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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-52148
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5214/


"Wirkung des Tyrosinkinase-Inhibitors Sunitinib auf die Proliferation und Apoptose von Keimzelltumoren in vitro"

"Effect of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib on the proliferation and apoptosis of germ cell tumors in vitro"

Hoch, Katharina Simone E.

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SWD-Schlagwörter: Hodenkrebs , Keimzelltumor , Hodentumor , Apoptose , Cisplatin
Freie Schlagwörter (Deutsch): Sunitinib, Tyrosinkinase-Inhibitor, Cisplatinresistenz, IC50, Zellzyklusanalyse
Freie Schlagwörter (Englisch): germ cell tumor, sunitinib, cisplatin resistance, tyrosine kinase inhibitor
Basisklassifikation: 44.81
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Honecker, Friedemann (PD Dr. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 14.07.2011
Kurzfassung auf Deutsch: In dieser Arbeit wurde die Wirksamkeit des Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitors Sunitinib auf Keimzelltumoren (KZT) getestet. Alle Untersuchungen wurden anhand von in vitro Versuchen sowohl an den Cisplatin-sensitiven KZT-Linien NT2, 2102EP und NCCIT als auch an den Cisplatin-resistenten Sublinien NT2-R, 2102EP-R und NCCIT-R durchgeführt.
Untersucht wurde zunächst die zytotoxische Wirkung von Sunitinib auf KZT-Linien. Dazu wurde mittels Zellzählungen und MTT-Messungen die IC50–Konzentration bestimmt. Die Ergebnisse der MTT-Messungen lagen zwischen 3 und 3,8µM, die der Zellzählungen zwischen 5 und 10µM. Bei den ermittelten Konzentrationen zeigten alle, also auch die Cisplatin-resistenten KZT-Linien ein gutes Ansprechen auf Sunitinib, womit eine Kreuzresistenz zwischen Sunitinib und Cisplatin ausgeschlossen werden konnte.
Es wurde außerdem in dieser Arbeit gezeigt, dass die Höhe der IC50 positiv mit der Anzahl ausgesäter Zellen korreliert. Zu diesem direkt proportionalen Zusammenhang konnte ein indirekt proportionaler Zusammenhang zwischen der IC50 und dem durchschnittlich jeder Zelle zur Verfügung stehenden Platz festgestellt werden.
Des Weiteren wurde die Kombinationstherapie von Sunitinib und Cisplatin, dem Standardmedikament der Therapie von KZT, untersucht. Dazu wurden die jeweiligen IC10–, IC25– und IC50–Konzentrationen beider Medikamente kombiniert und mit den Effekten verglichen, die sich unter einer Monotherapie mit Sunitinib ergaben. Ausgewertet wurden diese Ergebnisse ebenfalls anhand von Zytotoxizitätsassays und Zellzählungen viabler Zellen nach Behandlung. Hier zeigte sich in der Kombinationstherapie eine verstärkte Abnahme viabler Zellen, vor allem bei den Cisplatin-sensitiven Zelllinien. Zu einem geringeren Teil konnte dies auch bei den Cisplatin-resistenten Zellen beobachtet werden. Weiterer Gegenstand dieser Arbeit stellte die Analyse der Wirkung von Sunitinib auf pMEK und pERK dar. Hier wurde nach einer 48-stündigen Behandlungsdauer der KZT-Linien mittels Western Blot untersucht, ob sich die Expression von MEK und ERK bzw. pMEK und pERK verändert. Es zeigte sich, dass die pERK-Konzentration in den Zelllinien NT2, 2102EP sowie 2102EP-R gehemmt wurde. In den Zelllinien NT2-R, NCCIT sowie NCCIT-R wurde kein eindeutiger Effekt beobachtet. Ebenfalls war bei pMEK und ERK keine wesentliche Veränderung zu erkennen. MEK hingegen zeigte bei allen mit Sunitinib behandelten Zellen eine Abnahme der Expressionsstärke.
Mittels Western Blot wurden außerdem die beiden Apoptosemarker Caspase-3 und PARP auf erhöhte Aktivierung bzw. Spaltung untersucht. In den über 48 Stunden mit Sunitinib behandelten Zellen konnte jedoch keine Veränderung im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen festgestellt werden. Zusätzlich wurde die Caspase-3-Aktivität auch mittels FACS-Analyse untersucht. Auch hier konnte kein Unterschied beobachtet werden. Außerdem erfolgte nach 48-stündiger Behandlungsdauer eine Zellzyklusanalyse unter Einfluss von Sunitinib mittels FACS. Hier zeigte sich ebenfalls kein Unterschied zu den unbehandelten Kontrollzellen.
Kurzfassung auf Englisch: This work shows the effect of the tyrosine kinase inhibitor sunitinib on germ cell tumors in vitro. Sunitinib was testet on six different germ cell tumor cell lines: NT2, NCCIT, 2102 EP and their cisplatin resistant subclones NT2-R, NCCIT-R and 2102EP-R.
By MTT assays, IC50 values of cells treated with sunitinib ranged from 3 – 3,8 µM. No cross resistance was observed between cisplatin-sensitive and cisplatin-resistant cell lines. Furthermore this work demonstrates that the IC50 value correlates with the cell density.
There was no apoptosis shown by analyzing PARP and caspase 3 in western blot and FACS experiments. Sunitinib did not show any influence on the cell cycle regulation after 48 hours of treatment. It was observed that under a 48-hour-treatment with sunitinib, some cell lines (NT2, 2102EP, 2102EP-R) showed downregulation of phospho-ERK, some (NCCIT, 2102EP-R) showed downregulation of ERK and all of them showed downregulation of MEK.
It could also be proved that a combination therapy using sunitinib and cisplatin showed superior inhibition of cell proliferation especially in cisplatin-sensitive cell lines (2102EP and NCCIT) and to a lower degree in cisplatin-resistant cell lines (NCCIT-R).

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