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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-52281
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5228/


Einsatz von Antikörpern aus Gene-Gun Immunisierungen zur Charakterisierung von membranständigen P2X Purinrezeptoren

Usage of antibodies raised by gene-gun immunisation for the characterization of surface P2X purinoceptors

Möller, Sina

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SWD-Schlagwörter: Antikrper , Immunisierung
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.06.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 20.07.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit ist es, die Expression der membranständigen P2X1, P2X4, und P2X7 Purinrezeptoren auf der Zelloberfläche von murinen und humanen Immunzellen näher zu charakterisieren. Mit Hilfe neu hergestellter und kommerziell verfügbarer P2X-Antikörper sollte die Frage geklärt werden, auf welchen Zellen und Zelllinien welche Purinrezeptoren exprimiert werden. Hierfür wurden Immunfluoreszenz-, Immunpräzipitations-, Western Blot- und FACS-Analysen eingesetzt. Dabei wurden die Antikörper auch auf eine mögliche Kreuzreaktivität mit orthologen und paralogen Purinrezeptoren untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die α-Pincs die Zelloberflächenexpression von P2X1, P2X4 und P2X7 auf transfizierten Zellen sicher nachweisen können. Aus diesem Grunde konnten die α-Pincs zum Screening etablierter Zelllinien für die Expression von P2X Purinrezeptoren verwendet werden und ließen sich für FACS-Analysen an primären Immunzellen, wie den regulatorischen T-Zellen, einsetzen.
Mit Hilfe von ADP-Ribosylierungsassays wurde der Frage nachgegangen, ob neben dem murinen P2X7 auch weitere Purinrezeptoren als Ziel für die ADP-Ribosylierungen fungieren können. Die Analysen ergaben, dass eine Punktmutation genügt, um auch die P2X1 und P2X4 Purinrezeptoren zu Targetproteinen der ART2.2 zu machen. Dieses spricht zum einen für eine strukturelle Ähnlichkeit der P2X Purinrezeptoren. Zum anderen wirft es die Frage nach der Erkennungs-Spezifität der ART2.2 auf. Verschiedene Hypothesen zu dieser Frage wurden diskutiert.
Für verschiedene Experimente wurden Zellen benötigt, die nur einen P2X Purinrezeptor auf der Oberfläche exprimieren. Hierfür wurden CHO-Zellen, die bereits die ART2 auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, stabil mit murinen und humanen P2X1, P2X4, und P2X7 transfiziert.
Kurzfassung auf Englisch: Following their release from cells, ATP and NAD, the universal currencies of energy metabolism, function as extracellular signalling molecules. Mammalian cells express numerous purinoceptors, i.e., the nucleotide-gated P2X ion channels and the G-protein-coupled P2Y receptors. Investigation of these receptors and enzymes has been hampered by the lack of available antibodies, especially ones that recognize these proteins in their native conformation. This study reports the use of genetic immunization to generate such antibodies against P2X(1), P2X(4), P2X(7). Genetic immunization ensures expression of the native protein by the cells of the immunized animal and yields antibodies directed against proteins in native conformation. Such antibodies are especially useful for immunofluorescence and immunoprecipitation analyses, whereas antibodies against synthetic peptides usually function well only in Western-blot analyses. Here we illustrate the utility of the new antibodies to monitor the cell surface expression of and to purify some key players of purinergic signalling.

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