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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-52343
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5234/


Etablierung eines kardialen Langzeitgentransfers zur Abschaltung des Phosphatase-Inhibitors-1 mittels Adeno-assoziierter Virus-Vektoren auf Basis von RNA-Interferenz

Development of a cardiac long-term gene transfer for knockdown of phosphatase-inhibitor-1 using adeno-associated virus-vector mediated RNA interference

Neuber, Christiane

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SWD-Schlagwörter: RNS-Interferenz , Herzmuskel , Phosphoproteinphosphatase , Beta-1-Rezeptor , Chronische Herzinsuffizienz , Dependoviren , Gentransfer
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteinphosphatase-Inhibitor-1 , Adeno-assoziiertes Virus , Fibrin-basierte mini-EHTs (FBMEs)
Freie Schlagwörter (Englisch): protein phosphatase inhibitor-1 , Adeno-associated virus , fibrin-based mini-EHTs (FBMEs)
Basisklassifikation: 42.20 , 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Korth, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 20.07.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Einen zentralen Bestandteil in der Pharmakotherapie der chronischen Herzinsuffizienz stellt die Blockade von myokardialen Beta-Adrenozeptoren (AR) durch sogenannte Blocker dar. Da unter Beta-Blocker-Gabe alle Prozesse, die der Stimulation von Beta1-AR nachgeschaltet sind, blockiert werden, ist dieser Therapieansatz unter Umständen mit unerwünschten Nebenwirkungen und Unverträglichkeiten verbunden. Kürzlich konnte der Phosphatase-Inhibitor-1 (Inhibitor-1) als ein distaler und positiv-wirkender Modulator der Beta-AR Signalkaskade identifiziert werden. Die genetische Defizienz von Inhibitor-1 in Mäusen vermittelte einen eindrücklichen Schutz vor Katecholamin-induzierter Herzinsuffizienz und Arrhythmien, ohne jedoch die basale Kontraktionskraft oder die Herzfrequenz zu beeinflussen. Somit scheint eine spezifische Hemmung von Inhibitor-1, im Sinne einer „distalen Beta-Blockade“, möglicherweise selektiver den pathologischen Aspekten einer Herzinsuffizienz entgegenwirken zu können. Da derzeit keine niedermolekularen Substanzen für eine spezifische pharmakologische Inaktivierung von Inhibitor-1 zur Verfügung stehen, war es das Ziel dieser Arbeit, die Grundlagen für einen herzspezifischen Inhibitor-1 Knockdown im Tiermodell, insbesondere im Hinblick für eine potentielle gentherapeutische Anwendung, zu schaffen. Des Weiteren sollte der Ansatz einen direkten Vergleich zur spezifischen Genabschaltung des Beta1-AR ermöglichen.
Es wurden zunächst siRNA-Sequenzen gegen den Inhibitor-1 und den Beta1-AR in silico konstruiert und synthetisiert. Deren biologische Effizienz wurde anschließend in Form von exogen applizierter siRNA und endogen produzierter shRNA in verschiedenen Zellsystemen getestet. Um optimale Testbedingungen zu gewährleisten, wurden Zelllinien generiert, die jeweils eines der beiden Proteine stabil exprimierten. Die Knockdown-Effekte wurden sowohl auf mRNA- (mittels qRT-PCR) als auch auf Proteinebene (mittels Western Blot bzw. Bindungsassay) quantifiziert und mit den entsprechenden wirkungslosen Kontroll-siRNAs verglichen. Dabei konnte eine Überlegenheit des shRNA-vermittelten Knockdowns gegenüber der exogen applizierten siRNA anhand einer Reduktion der mRNA- und Proteinkonzentration von Inhibitor-1 und Beta1-AR um bis zu 80% aufgezeigt werden. Die jeweils effizientesten Sequenzen wurden zur Generierung der rAAV-shRNA-Vektoren für den Gentransfer verwendet. Auf Grund der besseren in vitro Transduktionseffizienz wurden für die Evaluation in Zellsystemen zunächst Vektoren vom Serotyp 6 verwendet, wodurch die Inhibitor-1 Proteinmenge um ca. 50% und die Beta1-AR Proteinmenge um ca. 65% vermindert werden konnten. Zusätzlich wurde der rAAV-vermittelte Beta1-AR Knockdown in einem hochsensitiven in vitro Testsystem künstlicher Herzmuskelgewebe, den Fibrin-basierten mini-EHTs (FBMEs) untersucht. Die Transduktionseffizienz in FBMEs betrug nahezu 100% und führte zu einer Beta1-AR Downregulation von >70%. Unerwarteterweise entwickelten diese Konstrukte eine verbesserte Kontraktilität.
In vivo konnte der Gentransfer von shRNA-exprimierenden rAAV9-Vektoren erfolgreich an C57/BL6-Mäusen durchgeführt werden, ohne dass sich konkrete Hinweise auf eine AAV- und/oder eine shRNA-vermittelte kardiale Toxizität erkennen ließen. So konnte, trotz relativ geringer Virusmengen (~3*10^11 Vg/Maus), die kardiale Inhibitor-1 Expression im Gesamtherzen um etwa ein Drittel reduziert werden. Die funktionelle Analyse dieser Tiere mittels Echokardiographie in vivo zeigte eine Tendenz zur Desensibilisierung gegenüber akuter beta-adrenerger Stimulation, welche sich durch einen verminderten Anstieg der Herzkraft nach Dobutamingabe darstellte. Passend dazu erschien die Phosphorylierung von PLB (Ser16) vermindert. Diese Beobachtungen decken sich sehr gut mit Befunden in Inhibitor-1 Knockout-Mäusen und sprechen grundsätzlich für eine erfolgreiche Etablierung dieses Ansatzes. Allerdings waren die Versuche auf Grund der geringen Anzahl an untersuchten Tieren nicht statistisch signifikant und müssen in Zukunft optimiert werden.
Insgesamt konnte durch diese Arbeit eine sehr gute Basis für eine zukünftige Überprüfung der Wirksamkeit einer therapeutischen, AAV-vermittelten Inhibitor-1 Genausschaltung im Kontext einer experimentell induzierten Herzinsuffizienz geschaffen werden. Eine protektive Wirkung der Inhibitor-1 Herunterregulation auf den Verlauf der experimentellen Herzinsuffizienz könnte den Weg für die Entwicklung klinisch anwendbarer Ansätze zur therapeutischen Modulation dieser vielversprechenden Zielstruktur ebnen.
Kurzfassung auf Englisch: A key component in the pharmacotherapy of chronic heart failure is the permanent blockade of myocardial beta-adrenoceptors (AR) by so called beta-blockers. After beta-blocker administration all processes downstream of the beta1-AR are blocked, which may be associated in part with undesirable side effects and incompatibilities. Recently the protein phosphatase-1 inhibitor-1 (inhibitor-1) was identified as a distal and positive-acting modulator of beta-AR signaling. Notably, genetic ablation of inhibitor-1 in mice resulted in an impressive protection from catecholamine-induced heart failure and arrhythmias, without affecting basal contractile force or heart rate. Thus a specific inhibition of inhibitor-1, resembling kind of “distal beta-blockade”, may counteract more specifically the pathological aspects of heart failure. However, small molecules for a pharmacological inactivation of inhibitor-1 are not available yet. Therefore this study aimed to establish the experimental conditions for a successful inhibitor-1 knockdown in the mouse heart, particularly in respect of a future gene therapy application. Furthermore, this approach should allow a head-to-head comparison with specific gene silencing of the beta1-AR.
First, siRNA sequences targeting specifically the inhibitor-1 and the beta1-AR were designed in silico and synthesized commercially. The knockdown efficiency was then tested by exogenously applied siRNA and compared with endogenously produced shRNA in different cell systems. To ensure optimal experimental conditions, stable cell lines either expressing inhibitor-1 or the beta1-AR were generated. Knockdown efficiency was quantified both on mRNA (by qRT-PCR) and on protein level (by western blot and binding assay, respectively) and compared to the corresponding non-silencing control siRNAs. The shRNA-mediated knockdown approach was superior to the exogenously administered siRNA, showing a reduction of inhibitor-1 and beta1-AR up to 80% The most efficient sequences were used to generate rAAV-shRNA vectors for gene transfer. Due to stronger in vitro transduction efficiency vectors of the serotype 6 were used for the in vitro evaluation, whereby the inhibitor-1 and the beta1-AR protein levels were reduced by about 50% and 65%, respectively. Moreover, rAAV-mediated beta1-AR knockdown was investigated in a highly sensitive in vitro test system of artificial heart muscle tissue constructs in fibrin-based mini-EHTs (FBMEs). Transduction efficiency in FBMEs was almost 100% resulting in a beta1-AR downregulation >70%, whereby these constructs unexpectedly exhibited higher force generation and higher response to beta-AR stimulation.
In vivo, gene transfer by shRNA-expressing rAAV9 vectors was successfully applied in C57/BL6 mice, without any evidence of AAV- and/or shRNA-mediated cardiac toxicity. By this means, cardiac inhibitor-1 expression in the total heart was reduced about one third, despite using relatively low amounts of virus (~3*10^11 vg/mouse). Functional analysis of these mice by echocardiography revealed indeed a tendency to desensitization against beta-adrenergic stimulation, as indicated by a reduced inotropic response to acute dobutamine stimulation. Similarly phosphorylation of the inhibitor-1 downstream target and SERCA-pump regulator phospholamban (at Ser16) tented to be reduced. These observations are well compatible with the cardiac phenotype in inhibitor-1 knockout mice and suggest obviously a successful establishment of this approach. However, these results did not reach statistical significance due to the small number of animals and have to be further improved in the future.
Overall, this study established the experimantal conditions to test the potential benefits of an AAV-mediated inhibitor-1 knockdown in vivo in the context of pre-existing heart failure. A protective effect of inhibitor-1 knockdown on the course of heart failure could pave the way for the development of clinically applicable approaches to therapeutic modulation of this promising target structure.

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