Host Induced Gene Silencing - strategies for the improvement of resistance against Cercospora beticola in sugar beet (B. vulgaris L.) and against Fusarium graminearum in wheat (T. aestivum L.) and maize (Z. maysL.)

Abstract

The greater goal of this work was to establish host induced gene silencing (HIGS) in the F. graminearum- wheat and C. beticola- sugar beet pathosystem. Several approaches were taken to evaluate strategies for increased resistance against F. graminearum and C. beticola in sugar beet, wheat, and maize, as well as in the model plant B., distachyon. Different vectors were employed for RNA interference based silencing of fungal genes in the plant hosts. Firstly, silencing of the reporter gene GFP was established as a proof of concept of RNAi based gene silencing in C. beticola, a foliar pathogen of sugar beet. Secondly, CTB2 was characterized as a virulence gene in C. beticola with great potential as a target for gene silencing. This gene, an O-methyl-transferase in the toxin cercosporin biosynthesis cluster, is essential for toxin production and pathogenicity of C. beticola on sugar beet. The null mutant was unable to penetrate host tissue and cause disease symptoms. CTB2 will be a promising target for HIGS experiments in the future.Thirdly, different silencing constructs targeting Fgl1, a virulence factor, and Homoaconitase, an essential gene in F. graminearum, were cloned and attempted to transform into wheat by particle bombardment, but no transgenic plants could be achieved. Transgenic B. distachyon plants expressing an RNAi construct targeting Fgl1 were successfully generated by Agrobacterium mediated transformation in order to establish HIGS against F. graminearum in a model plant for wheat. An inducible silencing construct against Fgl1 was cloned for maize transformation. It was attempted to characterize Homoaconitase in F. graminearum by gene deletion and silencing, but no transformants could be achieved. Also, the role of Dicer 1 was to be elucidated in F. graminearum to answer the question whether the fungal or the host plant Dicer and RNAi machinery are responsible for the dsRNA processing of HIGS constructs. So far, no gene deletion or silencing mutants could be generated. Fourthly, previously generated transgenic wheat lines with an inducible silencing construct against an endogenous gene involved in stress response in wheat and maize, deoxy hypusine synthase (DHS), were characterized to the T1 generation. The construct was induced by heat shock and greatly reduced DHS levels were shown by qPCR. A DHS silencing construct for maize transformation was generated and transformed into maize, resulting in several transgenic lines. Moreover, DHS overexpression was studied in maize with transgenic lines previously generated with an inducible construct, revealing a salt stress sensitive phenotype.

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, host induced gene silencing (HIGS) in den wechselwirkenden Organismen Weizen- F. graminearum und Zuckerrübe- C. beticola zu etablieren. Dabei wurden verschiedene Herangehensweisen gewählt um silencing von Pilzgenen über die Wirtspflanze zu erreichen. Erstens wurde RNAi basiertes gene silencing am Beispiel des Reportergens GFP in C. beticola erfolgreich angewandt. Zweitens wurde CTB2 wurde als wichtiger Virulenzfaktor im Blattpathogen C. beticola und als mögliches Zielgen für RNAi vermitteltes silencing charakterisiert. CTB2 ist eine O-Methyltransferase im Cercosporin- Biosynthese- Cluster. Eine Nullmutation bewirkt den Verlust des Toxins Cercosporin und der Virulenz des Pilzes. Es konnte histologisch gezeigt werden, dass die Penetration der Wirtspflanze durch Ausschalten von CTB2 verhindert wurde. CTB2 ist sehr gut für HIGS geeignet, da es ein pilzspezifisches Gen und für die Pathogenität unerlässlich ist. Drittens wurde Weizen mit RNAi Konstrukten gegen Fgl1 und Homoaconitase, wichtige Virulenz- und Fitnessfaktoren in F. graminearum, transformiert. Obwohl ca. 8000 Embryonen transformiert wurden und verschiedene Kontrollen positiv verliefen, konnten keine transgenen Pflanzen erzeugt werden. Daher wurde ein Fgl1 RNAi Konstrukt in die Modellpflanze B. distachyon transformiert, was zu mehreren transgenen Linien führte. Dieses Experiment zeigte, dass HIGS in B. distachyon möglich ist und dieses Modell eine relativ schnelle und einfache Möglichkeit bietet, Vektoren zu testen, die später in Weizen angewandt werden sollen. Darüber hinaus wurde ein induzierbares RNAi Konstrukt gegen Fgl1 für die Maistransformation kloniert. Homoaconitase, ein Zielgen für HIGS und ein essentielles Gen in der Lysinsynthese des Pilzes, sollte in F. graminearum näher untersucht werden, aber es konnten keine Deletionsmutanten oder knock down Stämme erreicht werden. Auch Dicer 1 sollte im Zuge dieser Experimente in F. graminearum untersucht werden, da es eine wichtige Rolle beim silencing spielt und die Frage geklärt werden muss, ob beim Host Induced Gene Silencing (HIGS) die RNAi Maschinerie der Wirtspflanze die dsRNA prozessiert, oder ob dieser Prozess innerhalb des Pilzes stattfindet. Bisher scheiterten aber sämtliche Deletions- und silencing Versuche. Viertens wurde Deoxyhypusinsynthase (DHS), ein Gen, das bei Alterung und Stress eine wichtige Rolle spielt, in Weizen und Mais untersucht. In einer vorigen Arbeit hergestellte DH- RNAi- Weizenlinien mit einem induzierbaren Vektor wurden bis zur T1 Generation untersucht. Der Hitzeschock zur Induktion wurde erfolgreich etabliert und stark reduzierte DHS- Expression konnte mit qPCR gezeigt werden. Ein DHS- RNAi- Konstrukt gegen das endogene Mais- DHS- Gen wurde kloniert und transformiert, was in mehreren transgenen Linien resultierte. Außerdem wurden Maispflanzen mit einem induzierbaren DHS Überexpressionskonstrukt aus einer vorherigen Studie bis zur T2 untersucht, wobei ein gegenüber Salzstress sensitiver Phänotyp beobachtet werden konnte.