Auswirkungen einer Depletion der humanen Inositol-Polyphosphat 5-Phosphatase OCRL auf Transportwege des Mannose 6-Phosphat-Rezeptors

Abstract

Das Lowe-Syndrom (LS) ist eine X-chromosomal erbliche Multisystemerkrankung, die durch mentale Retardierung, Hypotonie, kongenitale Katarakt und selektive proximale Tubulopathie gekennzeichnet ist. Verursacht wird das LS durch Mutationen im OCRL-Gen, das für die Inositol-Polyphosphat 5-Phosphatase OCRL kodiert, ein Protein, das bevorzugt PI(4,5)P2 zu PI(4)P dephosphoryliert. Die weitläufige subzelluläre Verteilung lässt eine Beteiligung von OCRL an Transportprozessen zwischen Golgi und Endosom sowie Plasmamembran und Endosom vermuten. In Hautfibroblasten von Patienten mit LS wurde in einer früheren Arbeit eine reduzierte Aufnahme des lysosomalen Enzyms Arylsulfatase B über den Mannose 6-Phosphat (M6P)-Rezeptor beobachtet, was zu der Annahme führte, dass OCRL eine allgemeine Funktion bei der Clathrin-vermittelten Endozytose von Zelloberflächenproteinen spielen könnte. Um dieser Hypothese nachzugehen, wurde in dieser Arbeit die siRNA (small interfering RNA)-vermittelte Depletion von OCRL in HeLa-Zellen etabliert. Mittels Zelloberflächenbiotinylierungsexperimenten wurde die Clathrin-abhängige Endozytose von zwei Rezeptoren, dem Transferrin- und dem 300 kDa schweren M6P-Rezeptor (MPR300), analysiert. Für den Transferrin-Rezeptor ergab sich im Vergleich zu Kontrollzellen keine veränderte Internalisierung nach OCRL-Depletion. Dieses Ergebnis konnte durch Verwendung von über das Flp-In-System erzeugte, stabil OCRL-überexprimierende CV1-Zellen bestärkt werden. Aufgrund dieser Daten wird für OCRL keine allgemeine Funktion in der Clathrin-abhängigen Endozytose angenommen. Mit der oben erwähnten Biotinylierungsmethode konnte jedoch sowohl eine erhöhte Menge an Plasmamembran-ständigen MPR300 als auch eine erhöhte Internalisierungsrate des MPR300 in OCRL-depletierten Zellen detektiert werden. Da diese Ergebnisse vermutlich nicht auf eine gestörte Endozytose zurückzuführen waren, wurden weitere Experimente zum M6P-Rezeptor-Trafficking in OCRL-depletierten Zellen durchgeführt. In einem pulse-chase-Experiment wurde zunächst die Halbwertszeit des MPR300 bestimmt, die, wie auch die MPR300-Gesamt-Proteinmenge, unverändert war. In Immunfluoreszenzexperimenten konnte eine Relokalisation des MPR300 in vergrößerten, vesikulären Strukturen beobachtet werden, die mittels Kolokali-sationsexperimenten als Intermediärformen des frühen Endosoms charakterisiert wurden. Unter Verwendung einer den MPR46 (46 kDa schwere M6P-Rezeptor-Variante)-stabil exprimierenden HEK-293-Zelllinie in einem radioaktiven Sulfatidierungsexperiment wurde nach OCRL-Depletion ein um etwa 54 % verminderter Rücktransport des M6P-Rezeptors vom Endosom zum TGN detektiert. Ein weiteres pulse-chase-Experiment zur Messung der extrazellulären Aktivität saurer Hydrolasen, den Liganden des M6P-Rezeptors, erbrachte keinen Hinweis auf eine erhöhte Sekretion dieser lysosomalen Enzyme ins extrazelluläre Medium. Zusammen-genommen führten diese Daten zu der Annahme, dass der verminderte retrograde M6P-Rezeptor-Transport durch eine erhöhte MPR300-Menge an der Plasmamembran und eine gesteigerte Internalisierung dieses Rezeptors in OCRL-depletierten Zellen kompensiert wird. In Immunfluoreszenzanalysen konnten darüber hinaus mehr und größere, durch den Marker Lamp1 detektierbare Lysosomen in OCRL-depletierten HeLa-Zellen als in Kontrollzellen identifiziert werden. Die veränderte Lysosomenmorphologie ließ auf einen verminderten Proteinabbau in diesem Zellkompartiment, vermutlich bedingt durch eine reduzierte Menge lysosomaler Enzyme, schließen. Die Untersuchung des anterograden Transportwegs vom TGN zum Lysosom, den neu synthetisierte lysosomale Enzyme durchlaufen, mittels verschiedener radioaktiver und biochemischer Methoden ergab jedoch in OCRL-depletierten Zellen nur marginale Veränderungen. In dieser Arbeit konnte durch die Analyse der verschiedenen M6P-Rezeptor-Transportwege gezeigt werden, dass der retrograde Transport vom Endosom zum TGN in OCRL-depletierten Zellen wesentlich vermindert ist. Damit einhergehend kommt es vermutlich zu einer vermehrten Einschleusung der M6P-Rezeptoren in den endozytotischen Transportweg. In Komplementationsexperimenten wurde gezeigt, dass der 5-Phosphataseaktivität von OCRL eine wesentliche Rolle beim M6P-Rezeptor-Trafficking in der Zelle zukommt. Die OCRL-vermittelte Dephosphorylierung von PI(4,5)P2 zu PI(4)P könnte lokal am frühen Endosom für den retrograden Transport wichtig sein: Die Bedeutung der Inositol-Polyphosphat 5-Phosphatase OCRL für das M6P-Rezeptor-Trafficking weist daraufhin, dass in einigen Geweben von Jungen mit LS intrazelluläre Transportwege in ihrer Funktion beeinträchtigt sein könnten.

Lowe syndrome (LS) is a rare X-linked disease characterized by mental retardation, hypotonia, congenital cataract, and a selective proximal tubulopathy. LS is caused by mutations in the OCRL (oculocerebrorenal syndrome of Lowe) gene encoding the inositol polyphosphate 5-phosphatase OCRL. OCRL preferentially hydrolyzes PI(4,5)P2 to PI(4)P. Based on the substrate specificity of OCRL, its localization to endocytic membrane trafficking compartments and the involvement of its binding partners in vesicle trafficking, we put forward the hypothesis that OCRL is implicated in intracellular trafficking processes. We initially used fibroblast cells from six patients with LS and confirmed deficiency of OCRL or the presence of a truncated OCRL mutant protein by western blotting. Internalization of transferrin, EGF, and LDL was normal in LS fibroblasts. However, we found a significantly reduced uptake of the lysosomal enzyme arylsulfatase B, which is internalized via the mannose 6-phosphate (M6P) receptor. To analyze M6P receptor trafficking in more detail, we established a cellular model system by downregulation of OCRL using siRNA-mediated knockdown in HeLa cells. Next, we established cell-surface biotinylation to analyze internalization of the transferrin receptor and the M6P receptor of 300 kDa (MPR300). We did not observe a significant difference in the internalization of the transferrin receptor in OCRL-depleted cells compared with control cells that is in line with our findings in LS fibroblasts. Similarly, stable overexpression of wild-type OCRL in CV1 cells did not cause any alteration in transferrin receptor internalization. In marked contrast, we found an increase in the amount of cell-surface MPR300 that is accompanied by an increased amount of internalized MPR300 in OCRL-depleted cells. In addition, the internalization rate of the MPR300 was 13.4 %/min in OCRL-depleted cells in comparison to 8.6 %/min in control cells. Next, we studied the half life of the M6P receptor. In a pulse-chase experiment, the MPR300 was radioactively labeled and the degradation rate was determined indicating a normal half life in OCRL knockdown cells. Furthermore, the total cellular amount of the MPR300 was unchanged in cells depleted of OCRL. Immunofluorescence analysis using a laser scanning microscope revealed relocalization of the M6P receptor in enlarged, vesicular structures in OCRL-depleted cells. By colocalization of these enlarged MPR300-positive structures with different vesicular marker proteins, such as GM130, TGN46, EEA1, SNX1, Rab5 and Rab7, we characterized them as early-to-late endosomal intermediates. By overexpression of siRNA-resistant OCRL variants, we were able to rescue accumulation of the M6P receptor in enlarged vesicles with wild-type OCRL, while upon expression of a mutant OCRL, deficient for the 5-phosphatase activity, the M6P receptor still accumulates in large endosomal vesicles. These data suggest that the 5-phosphatase activity of OCRL has an important function in trafficking of the M6P receptor. We next analyzed the retrograde transport of the M6P receptor detected via an in vivo endosome-to-TGN transport assay using a HEK-293 cell line which stably expresses a 46 kDa M6P receptor variant (MPR46) (achieved in the lab of Professor Dr. Suzanne R. Pfeffer, Stanford University School of Medicine, CA, USA). We identified a reduced retrograde transport of 54 %, suggesting that the M6P receptor accumulation in the endosomal compartment in OCRL-depleted cells is due to the observed decrease in the retrograde transport. The partially blocked retrograde transport did not result in an increase in the secretion of lysosomal enzymes as the amount of secreted cathepsin Z and hexosaminidase, detected via pulse-chase labeling and enzymatic activity measurement, was normal in OCRL knockdown cells. We next studied the anterograde transport from the TGN to lysosomes. We did not observe any alteration in the lysosomal delivery of cathepsin Z, however, the steady state detection of the lysosomal enzyme cathepsin D revealed an increased amount of the late endosomal intermediate form of cathepsin D (48 kDa). Immunostaining experiments identified an increased amount of Lamp1-positive lysosomes in OCRL-depleted cells. Further studies are necessary to characterize the abnormal lysosomal morphology and clarify whether there is a reduced amount of lysosomal enzymes in lysosomes of OCRL-depleted cells. In summary, we identified a significantly reduced retrograde transport in OCRL-depleted cells that likely results in accumulation of the M6P receptor in early-to-late endosomal intermediates as well as on the cell surface. Our data indicate an important function of the inositol polyphosphate 5-phosphatase OCRL in M6P receptor trafficking suggesting that defects in intracellular trafficking pathways, particularly M6P receptor trafficking, contribute to the clinical manifestations in LS-affected patients.