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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-53025
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5302/


Charakterisierung der Hepatitis C Virus Biogenese

Characterization of Hepatitis C Virus Biogenesis

Banning, Carina

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SWD-Schlagwörter: Hepatitis-C-Virus , Biogenese , Assembly
Basisklassifikation: 42.32
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 01.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 05.09.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Die Hepatitis C Virus (HCV) Infektion ist eine der häufigsten Ursachen chronischer Lebererkrankungen mit lebensbedrohlichen Folgen. Nach Schätzungen der WHO sind ca. 3% der Weltbevölkerung mit HCV infiziert. Die aktuelle Standardtherapie ist nur bedingt wirksam und nicht direkt gegen das Virus gerichtet. Eine Impfung ist bisher ebenfalls nicht verfügbar. Die Entwicklung eines Zellkultursystems zur Produktion infektiöser Viren im Jahr 2005 legte die Grundlage zum besseren Verständnis des HCV Replikationszyklus. Dennoch sind nach wie vor wichtige Schritte wie HCV Assemblierung und Virus-ausschleusung nur unvollständig verstanden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde durch die Entwicklung und Charakterisierung neuer fluoreszenzmarkierter Reporterviren die Visualisierung der Biogenese von HCV in lebenden, virusproduzierenden Zellen ermöglicht. Erstmals wurden funktionelle Reporterviren konstruiert, die Fluoreszenz- und HCV Strukturproteine als Fusionsprotein exprimieren und somit ein wertvolles Werkzeug zur Analyse der späten Phase des viralen Replikationszyklus darstellen.
Durch den Einsatz dieser Reporterviren in Kombination mit verschiedenen Mikroskopietechniken und biochemischen Analysen konnte die räumliche und zeitliche Organisation der HCV Assemblierung und Virusfreisetzung untersucht werden. HCV Strukturproteine und Replikationskomplexe kolokalisieren initial an Lipidspeicherorganellen, den sogenannten lipid droplets (LD). Gemeinsam mit Membranen des Endoplasmatischen Retikulums (ER) stellen diese eine Oberfläche für den Zusammenbau von Viruspartikeln dar. HCV wird dann ausgehend vom ER in vesikulären Strukturen und unter Beteiligung früher Endosomen sekretiert.
Des Weiteren legen die Daten dieser Dissertation nahe, dass HCV zusätzlich zur gerichteten Sekretion viraler Partikel die Virusfreisetzung durch einen lytischen Schritt induziert. Die HCV Pathogenese kann kausal auf den Tod von Leberzellen zurückgeführt werden. Daher könnte diese Beobachtung eine wichtige Erkenntnis zum besseren Verständnis der Krankheitsentstehung im Rahmen der HCV Infektion sein.
In der Summe ist es erstmalig gelungen, die späten Schritte im HCV Replikationszyklus zu visualisieren. Dabei wurden zwei alternative Wege der Virusfreisetzung beschrieben und charakterisiert. Somit leistet diese Dissertation einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis der Hepatitis C Virus Infektion.
Kurzfassung auf Englisch: About 170 million people worldwide are infected with the Hepatitis C Virus (HCV). Due to the lack of a preventive vaccine and effective antiviral therapies, HCV infection remains one of the major health threads worldwide. The pathogenic mechanisms of HCV infection are still poorly understood. A recently developed tissue culture system that produces infectious virus progeny has greatly enhanced our current understanding of the HCV life cycle. Nevertheless, important steps i.e. the site of viral assembly, budding and egress remain largely elusive.
In this thesis HCV genomes were modified to express chromophores fused in frame within structural as well as non-structural proteins allowing the discrimination of sites of viral RNA replication from those of structural protein expression. With these fluorescently tagged viruses, viral protein localization and movement was analyzed in living cells over time. Furthermore, correlative microscopy techniques combining fluorescence imaging with electron microscopy provides a system to relocalize infected cells and visualize the localization of viral particles at the ultra-structural level.
Thereby a temporal and spatial organization of structural and non-structural protein expression was observed. Initially, structural proteins and replication complexes colocalized at the ER and at the surface of lipid droplets, which seem to act as an assembly scaffold. Later, structural proteins separated from non-structural proteins and localized to vesicles staining positive for early endosomes. Functional analyses confirmed an important role of early endosomes in viral egress and ultra-structural analyses demonstrates the presence of HCV particles in intracellular vesicles. Therefore HCV seems to bud through the ER into vesicular structures and is released dependent on the endosomal pathway.
Further microscopical and biochemical studies suggest an alternative, apoptosis-dependent lytic step in HCV release. Since HCV associated liver injury is directly related to cell death, this finding could have important implications for HCV pathogenesis.
In sum, HCV assembly and egress was successfully visualized for the first time. Thereby two alternative pathways of HCV release were identified and characterized. Thus, this thesis provides important contributions to the understanding of the HCV viral life cycle.

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