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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-53145
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5314/


Identifizierung und Charakterisierung der Ribohydrolase-(RH)-Familie aus dem Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. und ihr funktioneller knockout

Characterisation and functional gene knockout of the ribohydrolase-(RH)-family in the moss Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Turcinov, Hanna

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SWD-Schlagwörter: Physcomitrella patens , Pyrimidin , Pyrimidinstoffwechsel , Purin , Purinstoffwechsel , Knockout <Molekulargenetik> , Metabolismus , Inosin , Adenosin
Freie Schlagwörter (Deutsch): Ribohydrolase, Nukleosidhydrolase, Cytokinin
Freie Schlagwörter (Englisch): ribohydrolase, nucleosid hydrolase, cytokinin
Basisklassifikation: 42.13 , 42.52 , 42.41
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schwartzenberg, Klaus von (PD Dr)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.06.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 26.09.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Der Metabolismus von Purinen und Pyrimidinen ist von zentraler Bedeutung für das pflanzliche Wachstum und die Entwicklung, da die zugehörigen Nukleotide Bestandteile und Vorstufen zahlreicher wichtiger Substanzen sind. Ein Schlüsselenzym des Purin/Pyrimidin-Metabolismus ist das Enzym Ribohydrolase (RH), das die hydrolytische Spaltung von Ribosiden in Basen und Ribose katalysiert und darüber den Übergang von Recycling zum Katabolismus von Purin- und Pyrimidin-Metaboliten kontrolliert. In Mikroorganismen wurden RHs detailliert charakterisiert, RHs aus Pflanzen sind hingegen in der Literatur kaum beschrieben.
Ziel dieser Arbeit war eine umfassende Charakterisierung von RHs aus der basalen Landpflanze Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.. In vivo und in vitro Messungen von RH-Aktivität sowie Markierungsexperimente mit 3H-Purin-Ribosiden zeigten, dass Physcomitrella RH Aktivität besitzt. Über bioinformatische Methoden wurde die RH-Genfamilie identifiziert, die aus drei Mitgliedern besteht (PpRH1, -2 und -3). Phylogenetische Analysen zur Erstellung eines Stammbaumes ergaben zwei Hauptgruppen für pflanzliche RHs, wobei die meisten Spezies je einen Vertreter in beiden Gruppen besitzen. Vergleiche der genomischen Organisation zeigten, dass PpRHs eine hoch konservierte Intron/Exon-Struktur mit den meisten pflanzlichen RHs teilen. Für die Bestimmung der enzymkinetischen Parameter von PpRHs erfolgte die heterologe Expression in E. coli. Messungen der Substratspezifität identifizierten PpRH1 als eine Purin-bevorzugende RH, die neben dem Hauptsubstrat Inosin auch Aktivität an Adenosin, Guanosin, Xanthosin sowie dem Pyrimidin Uridin und dem Cytokinin Isopentenyladenosin (iPR) zeigt. Die optimalen Reaktionsbedingungen für PpRH1 für den Umsatz von Inosin waren bei 35 °C und einem pH von 7,5-8,0 gegeben. Gelfiltration über FPLC zeigte, dass PpRH1 als Quartärstruktur Dimere bildet, aber bei hohen Konzentrationen auch als Tetramer vorliegen kann. PpRH2 weist eine insgesamt niedrigere katalytische Aktivität als PpRH1 auf und setzt vorrangig das Pyrimidin Uridin um. Zur Entschlüsselung der 3D-Struktur von PpRH1 wurden erste Kristallisierungsansätze mit rekombinantem Protein realisiert. Die Bedeutung katalytisch wichtiger Aminosäuren wird anhand von site directed mutagenesis Experimenten diskutiert. Studien zur Expression von PpRH-GFP-Fusionsproteinen in Physcomitrella Protoplasten zeigten übereinstimmend eine cytoplasmatische Lokalisierung für PpRH1, -2 und -3 auf.
Um Gehalte von Purinen und Pyrimidinen im Gewebe von Physcomitrella zu erfassen, wurden LC MS/MS Messungen vorgenommen. Das hierbei erstellte Profil umfasst 15 verschiedene Purin- und Pyrimidin-Metabolite, die in nmolaren Mengen im Gewebe detektiert wurden.
Zur Untersuchung der physiologischen Relevanz von RHs wurden single-knockout Linien von PpRH1, 2 und -3 hergestellt. Knockout Linien von PpRH1 zeigten in in vitro Enzym-Assays keine Rest-Aktivität an Inosin. Die Inosin-Hydrolyse erfolgt demnach in Physcomitrella mit hoher Wahrscheinlichkeit PpRH1-abhängig. Anhand von HPLC-basierten in vivo Metabolismusstudien mit 3H- Purinen und -Cytokininen, sowie LC-MS/MS Messungen von steady state Gehalten von Purinen/Pyrimidinen, wurden die Folgen der verschiedenen RH-knockouts analysiert: Während der knockout von PpRH3 kaum Auswirkungen zeigte, wurde nach dem knockout von PpRH2 intrazellulär eine Akkumulation des Ribosids Uridin festgestellt. Beim PpRH1-KO waren die KO-bedingten Effekte am stärksten ausgeprägt: Hier führte der knockout zu einer beschleunigten Aufnahme von extern applizierten Ribosiden (Inosin, Adenosin, iPR) aus dem Kulturmedium. Die LC MS/MS-basierten Messungen wiesen außerdem eine generelle Akkumulation von Ribosiden im Gewebe nach (vorrangig Xanthosin, Inosin, Uridin, Guanosin). Aus den zu PpRH1 und PpRH2 erhobenen Daten werden folgende Schlüsse abgeleitet: PpRH2 repräsentiert eine RH-Nebenaktivität, die vorrangig auf die Hydrolyse von Pyrimidinen einwirkt und vermutlich hauptsächlich im Entwicklungsstadium des Gametophors von Bedeutung ist. PpRH1 übernimmt hingegen eine essentielle Funktion im Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel, da es die RH Hauptaktivität zum Abbau von Purin- und Pyrimidin-Ribosiden darstellt. Für einen funktionierenden Katabolismus von Ribosiden und der damit verbundenen Rückführung von Stickstoff ist Physcomitrella auf PpRH1-Aktivität angewiesen. Neben der Beteiligung am Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel wird auch eine Rolle von PpRHs beim Cytokinin-Stoffwechsel diskutiert.
Die vorliegenden Daten liefern einen Beitrag zur der bisher kaum untersuchten physiologischen Funktion von RHs im pflanzlichen Stoffwechsel und unterstreichen die Bedeutung von RHs für die Balance zwischen Katabolismus und Recycling von Purinen und Pyrimidinen. Aufgrund der phylogenetischen Stellung von Physcomitrella werden die erhobenen Daten genutzt, die physiologische Rolle von RHs unter evolutionsbiologischen Aspekten zu beleuchten.

Kurzfassung auf Englisch: Purine and pyrimidine metabolism is of central importance for the growth and development of plants since the corresponding nucleotides represent building blocks of nucleic acids, major energy carriers, and are components of essential coenzymes such as NAD, as well as being precursors of alkaloids and cytokinins. A key enzyme associated with purine and pyrimidine metabolism is ribohydrolase (RH) that catalyzes the hydrolytic cleavage of nucleosides to the corresponding bases and ribose, and thereby balances salvage and catabolism of purines and pyrimidines. RHs have been well characterized in microorganisms but relatively little is known about their contributions to plant metabolism.
This work aimed to comprehensively characterize RHs in the basal land plant Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. In vivo and in vitro measurement of RH activity as well as feeding studies with radiolabeled purines demonstrated that Physcomitrella exhibits RH activity. The three member RH gene family of Physcomitrella, PpRH1, -2 and -3, was identified using bioinformatic tools. Phylogenetic analysis of plant RHs revealed that they mainly cluster in two groups; for those species with multiple RHs genes, at least one resided in each group. Comparison of the genomic organization of PpRHs with other plant RHs demonstrated that they share a highly conserved intron/exon structure. The biochemical characteristics of PpRHs were estimated using recombinant protein produced in E. coli. Measurements of substrate specificity revealed PpRH1 to be a purine-preferring RH with the highest affinity for inosine. In addition, PpRH1 accepted adenosine, guanosine and xanthosine as well as the pyrimidine uridine and the cytokinin isopentenyladenosine (iPR) as substrates; however, the efficiency of substrate conversions varied widely. Optimal reaction conditions for the conversion of inosine were achieved at pH 7,5-8,0 and 35°C. Gel filtration using FPLC indicated dimer formation and at higher concentrations tetramer formation of PpRH1. PpRH2 possessed a much lower catalytic activity as compared to PpRH1. The highest catalytic activity of PpRH2 was measured for uridine as a substrate. Preliminary crystallization experiments with PpRH1 supported the conclusion that it forms homodimers; site-directed mutagenesis studies provided insight into key amino acids responsible for substrate specificity. The localization of PpRHs was studied by expression of GFP fusion proteins in protoplasts of Physcomitrella and consistently showed a cytoplasmic localization for PpRH1, -2 and -3.
A complementary study involved the measurement of purines and pyrimidines in Physcomitrella tissue using LC-MS/MS. The established profile comprised 15 different purine and pyrimidine metabolites each occurring in the nmolar range. Furthermore, purines and pyrimidines were detected in culture media.
To elucidate the physiological relevance of RHs, single knockouts for PpRH1, -2 and -3 were generated. In vitro enzyme assays using PpRH1 knockout lines showed no residual activity for inosine leading to the conclusion that inosine hydrolysis is mainly mediated by PpRH1. HPLC-based in vivo metabolism studies with tritiated purines and cytokinins as well as LC-MS/MS based measurements of steady state levels of purines and pyrimidines were used to analyze the impact of each RH knockout. Whereas the knockout of PpRH3 caused only slight changes, knockout of PpRH2 led to an intracellular accumulation of the riboside uridine. The knockout of PpRH1 had the strongest physiological impact showing an accelerated uptake of external supplied ribosides from the culture media (inosine, adenosine, iPR). In addition, LC-MS/MS based measurements revealed an overall accumulation of ribosides in PpRH1-KO tissue, with particular increases in xanthosine, inosine, uridine and guanosine. Although the role of PpRH3 was not resolved, the data obtained from the PpRH1 and PpRH2 knockout lines led the following conclusions: PpRH2 represents a minor RH activity mainly involved in the hydrolysis of pyrimidines and is most probably primarily active at the gametophore stage. In contrast, PpRH1 has an essential function in cellular metabolism by providing the main activity for hydrolysis of purine and pyrimidine ribosides. Physcomitrella relies on PpRH1 activity for the maintenance of riboside catabolism and the associated nitrogen recycling. Besides their contribution to purine and pyrimidine metabolism PpRHs may also be involved in cytokinin metabolism.
These data contribute to the understanding of the physiological role of RHs in plant metabolism and underline their significance for the balancing of purine and pyrimidine catabolism and salvage. The physiological significance of RHs in plants is interpreted with respect to the phylogenetic position of Physcomitrella in the plant kingdom.


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