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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-53365
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5336/


Molecular-Modelling-Untersuchungen zu strukturellen Voraussetzungen, Bindungsmodus und Design von Inhibitoren der plasmodialenGlykogen Synthase Kinase-3

Molecular modelling studies on structural requirements, binding mode, and design of PfGSK-3 inhibitors

Kruggel, Sebastian

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SWD-Schlagwörter: Molekulardesign , Malaria tropica , Glycogen-Synthase-Kinase-3 , Docking
Freie Schlagwörter (Deutsch): Proteinkinase , Homologie-Modell , Molekulare Interaktionsfelder
Freie Schlagwörter (Englisch): Molecular modelling , Malaria tropica , PfGSK-3 , Docking
Basisklassifikation: 44.42
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Duchstein, Hans-Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 27.09.2011
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Dissertation wurde mit Methoden des Molecular Modellings ein verbessertes Verständnis biologischer und chemischer Daten zu Thieno[2,3-b]pyridin-Derivaten in ihrer Eigenschaft als selektive Inhibitoren der Glykogen Synthase Kinase-3 von Plasmodium falciparum (PfGSK-3) entwickelt. Ausgangspunkt waren einerseits Untersuchungen, in denen die PfGSK-3 als mögliche Zielstruktur in der Bekämpfung der durch P. falciparum verursachten Malaria vorgeschlagen wurde (Droucheau, 2004). Andererseits war die Darstellung von Thieno[2,3-b]pyridinen als selektive Inhibitoren der PfGSK-3 bereits beschrieben worden (Brandt, 2009).

Da die dreidimensionale Struktur der PfGSK-3 bislang nicht experimentell ermittelt werden konnte, beschäftigt sich der erste Teil der Arbeit mit der Erstellung von Homologie-Modellen als Voraussetzung für die Anwendung strukturbasierter Methoden der Leitstrukturoptimierung. Dazu wurden basierend auf dreidimensionalen Strukturen des homologen humanen Enzyms, der humanen Glykogen Synthase Kinase-3β (HsGSK-3β), Homologie-Modelle entworfen. Durch den Einsatz 11 unterschiedlicher Vorlagen und das Erstellen von insgesamt 4400 Homologie-Modellen wurde der konformative Raum der PfGSK-3 erschöpfend repräsentiert. Die Modelle wurden einer umfassenden Evaluierung mit literaturbekannten Methoden unterzogen. Dazu wurde ein eigenes Bewertungsverfahren eingeführt, das Ergebnisse unterschiedlicher Evaluierungswerkzeuge zu einer übergreifenden Bewertung zusammenfasst (Rank-by-rank based consensus scoring, RCS). Dieses Vorgehen führte zur Auswahl qualitativ hochwertiger Homologie-Modelle, deren Stabilität zusätzlich in Moleküldynamiksimulationen bestätigt wurde.

Diese Modelle und die Kristallstrukturen der HsGSK-3β, die jeweils als Vorlagen eingesetzt worden waren, wurden vergleichend mit molekularen Interaktionsfeldern (MIFs) untersucht. Die visuelle Analyse ergab Unterschiede im Bereich der ATP-Bindetasche, die für die Aktivität und Selektivität von Inhibitoren der PfGSK-3 von Bedeutung sein können. Die paarweise Gegenüberstellung der Daten von Homologie-Modellen und deren Vorlagen mittels Hauptkomponentenanalyse (PCA) führte zu auswertbaren Ergebnissen, die die visuellen Befunde bekräftigten. Eine hierarchische PCA (CPCA) mit der Gesamtheit der untersuchten Proteine führte hingegen nicht zu interpretierbaren Modellen.

In der Folge wurden in orientierenden Docking-Studien unter Verwendung der entwickelten Homologie-Modelle verschiedene Hypothesen zum Bindungsmodus der untersuchten Thieno[2,3-b]pyridine entwickelt, aus denen Synthesevorschläge abgeleitet wurden. Einige davon konnten umgesetzt werden und führten zur Darstellung von bislang nicht beschriebenen Substanzen. Bei biologischen Testungen wurde ermittelt, dass diese im mikromolaren Bereich (IC50 von 11.5 bis 68 μM) präferentiell bis selektiv die PfGSK-3 gegenüber der im Testsystem eingesetzten Säuger-GSK-3 hemmen.

Zur genaueren Analyse des Bindungsmodus der untersuchten Thieno[2,3-b]pyridine wurde der Arbeitsablauf DoReCCoM entwickelt (Docking, Rescoring, Clustering, Complex Minimisation). Darin werden die Ergebnisse verschiedener Dockingprogramme kombiniert, es folgt ein Clustering der Verbindungen zur Reduktion der Datenmenge und ein Rescoring mit einer externen Scoringfunktion. Zuletzt werden die erhaltenen Protein-Ligand-Komplexe einer Energiemininierung unterzogen, ein abschließendes Rescoring in Entsprechung zum Ersten ergibt die durch das Verfahren vorhergesagte Priorisierung von Posen. Die Leistungsfähigkeit von DoReCCoM wurde durch ein Crossdocking literaturbekannter Inhibitoren der HsGSK-3β, für die Protein-Ligand-Komplexe vorliegen, überprüft. Es konnte eine klare Überlegenheit gegenüber der isolierten Anwendung der einzelnen in DoReCCoM integrierten Dockingprogramme gezeigt werden. Durch Anwendung von DoReCCoM auf den erweiterten Datensatz der Thieno[2,3-b]pyridine wurden unterschiedliche Bindungsmodi der ersten Docking-Studie reproduziert, es ergab sich jedoch eine andere Priorisierung der Modi.

Basierend auf Bindungsmodi, die dieser Priosierung zufolge als wahrscheinlich gelten konnten, wurden Überlagerungen generiert und zur Erstellung von 3D-QSAR-Modellen herangezogen. Die bei der Analyse der CoMSIA-Modelle erhaltenen Konturdiagramme ermöglichten nach Projektion in die ATP-Bindetasche der Homologie-Modelle eine Kombination von struktur- und ligandbasierten Informationen. Als Resultat wird für den gesamten Datensatz ein gemeinsamer Bindungsmodus angenommen, der Ähnlichkeit zu einer nicht veröffentlichten Kristallstruktur eines Thieno[2,3-b]pyridins im Komplex mit der HsGSK-3β aufweist. Eine experimentelle Bestätigung des postulierten Bindungsmodus bleibt nachfolgenden Arbeiten vorbehalten.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this thesis was to improve the understanding of biological and chemical data of thieno[2,3-b]pyridines as selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 of Plasmodium falciparum (PfGSK-3) by using molecular modelling methods. Starting points were the elucidation of PfGSK-3 as potential target for the treatment of malaria tropica (Droucheau, 2004) and the synthesis of a series of thieno[2,3-b]pyridines as selective inhibitors of PfGSK-3 (Brandt, 2009).

An experimental three-dimensional structure of PfGSK-3 has not been published yet. Therefore the first step in the project was to build homology models for structure-based drug design. To this end, homology models were constructed based on 11 different crystal structures of HsGSK-3β, the human analogue of PfGSK-3. This process led to 4400 3D models representing the conformational space of PfGSK-3. The structures were evaluated according to established evaluation tools for homology models. The evaluation data were combined in a novel assessment system by calculating a rank-by-rank based consensus score (RCS). This results in the selection of high quality homology models the stability of which was confirmed in molecular dynamic simulations.

The homology models and corresponding templates were analysed and compared by means of molecular interaction fields (MIFs). The visual analysis elucidated differences between the ATP-binding site of the plasmodial and human enzymes that may contribute to selectivity of the ATP competitive inhibitors. A pairwise statistical analysis of models and templates via principal component analysis (PCA) confirmed the results of the visual analysis, whereas a consensus PCA (CPCA) did not lead to interpretable models for the entirety of investigated protein structures.

Subsequent docking studies were performed to provide a presumed binding mode for the compounds, in order to generate proposals for the synthesis of new derivatives. Some of these proposals were carried out leading to new compounds, which were tested for their inhibitory activity against plasmodial and mammal GSK-3 revealing values against PfGSK-3 in the micromolar range (IC50 of 11.5 to 68 μM) with selectivity towards the plasmodial enzyme.

In order to analyse the binding mode of the investigated thieno[2,3-b]pyridines in-depth, the workflow DoReCCoM was developed (Docking, Rescoring, Clustering, Complex Minimisation), where the results of different docking programs are combined, followed by a rescoring scheme with an external scoring function. Afterwards the poses are clustered to reduce the amount of data. At last, a complex minimisation with subsequent rescoring is carried out to prioritise the predicted docking poses. The capabilities of DoReCCoM were tested by a crossdocking experiment using published protein-inhibitor complexes of HsGSK-3β. The results obtained using DoReCCoM were superior compared to those of each docking program individually and, therefore, the procedure was applied to the dataset of thieno[2,3-b]pyridines in the PfGSK-3. Binding modes of the first docking were reproduced, but the prioritisation was different.

Finally, 3D-QSAR-CoMSIA models were developed based on alignments reflecting the prioritization of the proposed binding modes. Analysis of the respective contour maps enabled the combination of ligand and structure-based information. As a consequence, one common binding mode for all investigated thieno[2,3-b]pyridines is postulated. It can be characterised as similar to an unpublished X-ray crystal structure of a member of the dataset in complex with the HsGSK-3β. Experimental confirmation of the proposed binding mode of thieno[2,3-b]pyridines as selective inhibitors of PfGSK-3 has to be performed in future studies.

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