Kontinuierliche, zielgerichtete Evolution hochaffiner Protein-Liganden für Therapie und Prävention am Beispiel des HIV-1 Proteins Rev und seines zellulären Cofaktors Sam68

Abstract

Die Suche nach neuen Strategien und Zielen für die Therapie von HIV-Infektionen konzentriert sich zunehmend auf zelluläre Faktoren, die für die Replikation des Virus unverzichtbar sind und nicht der hohen Variablität der HI-Viren selbst unterliegen. Zu den für die HIV-Replikation essentiellen, zellulären Cofaktoren zählt auch das Protein Sam68, welches direkt mit dem viralen Exportfaktor Rev interagiert. Die funktionelle Rolle von Sam68 im HI-viralen RNA-Metabolismus wird kontrovers diskutiert. Die Entwicklung potenter, transdominanter Inhibitoren der Rev/Sam68-Interaktion könnte die Frage beantworten, ob ein therapeutischer Eingriff auf der Ebene dieser Interaktion überhaupt möglich ist. Hierfür wurden zunächst die an der Interaktion beteiligten Domänen mit Hilfe von Deletionsmutanten des Sam68- und Rev-Proteins identifiziert. Die Analyse der Interaktion wurde sowohl im zellfreien (in vitro), als auch im zellulären System in eukaryotischen Zellkulturen (in vivo) durchgeführt. Dabei konnte die Sam68-Bindedomäne im Rev-Protein auf ein strukturelles Motiv bestehend aus den Regionen AS 18-24, AS 54-60 und AS 64-116 eingeschränkt werden. Die Kristallstruktur des Rev-Proteins und Modellvorstellungen hinsichtlich der Rev-Oligomerisierung verdeutlichen, dass die Sam68-Interaktionsstellen in Rev zum Teil in den für die Oligomerisierung wichtigen Bereichen (AS 18-24 und AS 54-60) und der C-terminalen Region (AS 64-116) des Proteins liegen. Möglicherweise ist Sam68 also ein zellulärer Cofaktor des Rev-Proteins, welcher unter anderem die Ausbildung eines höher geordneten Rev-Oligomers unterstützt. Das Fehlen funktionell essentieller Regionen und Bereiche der zusammengesetzten Sam68-Bindestelle schränkte die Funktionalität der Rev-Deletionsmutanten erwartungsgemäß soweit ein, dass sie nicht mehr in der Lage waren ein Reporterkonstrukt im quasi-lentiviralen System zu aktivieren und desweiteren eine gestörte Oligomerisierung in FRET-Analysen zeigten. Jedoch konnte überexprimiertes Sam68 die gestörte Exportfunktion von Rev partiell ersetzen. Die Rev-Deletionsmutanten wurden im proviralen Kontext untersucht, ob sie als kompetitiver Inhibitor das Wildtyp Rev-Protein und dadurch die Virusproduktion hemmen konnten. Ein solcher transdominant negativer Phänotyp wurde aber nicht beobachtet. Desweiteren zeigten alle Rev-Deletionsmutanten ein im Vergleich zum Wildtyp verändertes Lokalisationsmuster in der Zelle. Die genaue Eingrenzung der Rev-Bindedomäne in Sam68 ist in der Literatur umstritten. In dieser Arbeit konnte die Rev-Bindedomäne auf das lineare, Tyrosin-reiche Motiv AS 364-410 im C-Terminus eingegrenzt werden. Der in der Literatur beschriebene synergistische Effekt von Sam68 auf den Rev-abhängigen Export konnte in dieser Arbeit in einem quasi-lentiviralen Reportersystem nicht beobachtet werden. Die Überexpression von Sam68 im proviralen Kontext zeigte jedoch Variationen bezüglich des Synergieeffekts mit Rev, die eventuell auf unterschiedlichen Gebrauch von Reporterkonstrukten und/oder Assay-Bedingungen zurückzuführen sind. Desweiteren konnte eine Region (AS 321-330) in Sam68 identifiziert werden, deren Präsenz vermutlich essentiell für den inhibitorischen Effekt der transdominant negativen Sam68Δ330-443-Mutante ist. Die Deletion der Rev-Bindedomäne in den Sam68-Deletionsmutanten zeigte in dieser Arbeit sowohl im Reportersystem als auch im proviralen Kontext keinen Einfluss auf den Rev-abhängigen RNA-Export bzw. die Virusproduktion. Möglicherweise wird die Funktion des endogenen Sam68 durch die Überexpression dieser Deletionsmutanten nicht beinträchtigt, so dass dieses die Rev-Funktion als zellulärer Cofaktor unterstützen könnte. Dafür spricht, dass nur der Wildtyp und eine Mutante mit einer intakten Rev-Bindestelle nach Herunterregulierung der Virusproduktion durch eine Sam68ΔC-Mutante, den dominant-negativen Effekt komplementieren konnten. Basierend auf den Interaktionsanalysen wurde die lineare Region der Aminosäuren 364-410 in Sam68 einer Zufallsmutagenese zur Generierung einer Bibliothek unterzogen. Im anschliessenden Bio-Panning wurde mit Hilfe der Phagen-Display-Technologie ein Kandidat selektioniert, der im Phagen-ELISA im Vergleich zum Ausgangskonstrukt eine höhere Affinität zu Rev zeigte. Die Analyse der Bindung des isolierten Kandidaten GXI zeigte jedoch im zellfreien System (in vitro) im Vergleich zum Wildtyp nur eine schwache bzw. im zellulären System in eukaryotischen Zellkulturen (in vivo) keine Interaktion mit Rev. Der Grund für diese Diskrepanz ist unklar. Durch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Rev/Sam68-Interaktion beteiligten Domänen konnte diese Arbeit zum besseren Verständnis der Rolle von Sam68 als essentieller, zellulärer Cofaktor der HIV-Replikation beitragen. Ein Eingriff auf dieser Ebene würde daher einen möglichen Ansatzpunkt für eine potentielle HIV-Therapie liefern.