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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54240
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5424/


Künstliche Herzgewebe aus humanen embryonalen Stammzellen als Testsystem für Arzneistoffe

Human embryonic stem cell-derived Engineered Heart Tissue as a test system for pharmaceutical products

Schaaf, Sebastian

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SWD-Schlagwörter: Embryonale Stammzelle , Toxikologie , Pharmakologie , Q-T-Verlngerung , Herz
Freie Schlagwörter (Deutsch): künstliche Herzgewebe
Basisklassifikation: 44.38
Institut 1: Chemie
Institut 2: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Duchstein, Hans-Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 01.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war es, künstliche Herzgewebe (EHT) aus humanen Kardiomyozyten herzustellen und zu untersuchen, ob diese als System verwendet werden können, um Substanzen auf ihr proarrhythmisches Potential zu testen. Effekte einer Repolarisationshemmung durch hERG-Kanal-blockierende Substanzen standen dabei im Mittelpunkt des Interesses, da dies der Mechanismus von häufigen unerwünschten Arzneimittelwirkungen ist, die mitunter zu ventrikulären Tachykardien vom Torsades de pointe Typ führen kann. Das proarrhythmische Potential neuer Substanzen ist in den bisher zur Verfügung stehenden Tests nur unvollständig einzuschätzen und weil Torsades de pointe Arrhythmien zwar gravierend, aber sehr selten sind, wurde diese kardiotoxische unerwünschte Arzneimittelwirkung in der Vergangenheit bei einigen Substanzen erst in der späten klinischen Anwendung offengelegt. Die nach Todesfällen notwendige Marktrücknahme (z. B. Cisaprid, Terfenadin, Sparfloxacin, etc.) ist daher bis heute ein großes Problem in der Arzneimittelentwicklung. Bessere präklinische Testsysteme, vor allem solche, die auf humanen Kardiomyozyten basieren, könnten hier Abhilfe schaffen.

Zur Umsetzung dieses Ziels wurden als Zellquelle humane embryonale Stammzellen in vitro expandiert. Es wurden Protokolle etabliert und modifiziert, um aus diesen Zellen Embryoidkörperchen herzustellen und diese in Kardiomyozyten zu differenzieren. Das Differenzierungsprotokoll basierte auf drei Stufen, in denen jeweils unterschiedliche Kombinationen der Wachstumsfaktoren Activin A, BMP 4, FGF 2, DKK 1 und VEGF in genauer zeitlicher Abfolge zur kardialen Differenzierung führten. Es wurde eine Effizienz von über 40% α-Aktinin-positiven Zellen in der differenzierten Zellpopulation erreicht, und es konnten pro Ansatz 1 bis 2 x 106 differenzierte Zellen gewonnen werden, was im internationalen Vergleich sehr viel ist. Analysiert wurde die Differenzierung durch quantitative PCR von Genen, die in bestimmten Phasen der kardialen Entwicklung exprimiert werden. Aufgrund der hohen Ausbeute konnten aus dieser Zellpopulation ohne vorausgehende Selektion künstliche Herzgewebe hergestellt werden. Dabei wurde eine Methode verwendet, welche im Institut entwickelt worden ist und unter Verwendung von Fibrin und Silikonhaltern zur Ausbildung streifenförmiger Herzgewebe führt. Deren spontane Kontraktilität konnte in einer selbstentwickelten, video-optischen Messanlage automatisiert untersucht werden. Per Figurerkennung wurde die Kontraktion der EHTs gemessen und in Kraft umgerechnet. Aus den Rohdaten der Kraft über der Zeit wurden die Parameter Frequenz, Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit und –zeit errechnet, welche die Kontraktilität der EHTs genau beschrieben. Die bekannten proarrhyhmischen Substanzen Chinidin, Sertindol, Cisaprid, Procainamid, E-4031, Thioridazin, Dofetilid, und Ibutilid führten konzentrationsabhängig zu einer Verminderung der Relaxationsgeschwindigkeit und Veränderung der Regelmäßigkeit der Kontraktionen. Die Schwellenkonzentrationen für diese beiden Parameter lagen bei allen Substanzen im Bereich der im hERG-Assay ermittelten IC50 Werte, wobei die Veränderung der Regelmäßigkeit sich als etwas weniger empfindlich herausstellte als die Verminderung der Relaxationsgeschwindigkeit.

Hiermit konnte gezeigt werden, dass sich humane EHTs zur Testung des proarrhythmischen Potentials von Substanzen prinzipiell eignen. In Zukunft könnte so die Palette der präklinischen Untersuchungen zur kardialen Toxikologie erweitert, Substanzen vor der Markteinführung besser charakterisiert und die Tierversuch-intensiven Untersuchungsmethoden reduziert werden.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was to create engineered heart tissue from a human cardiomyocytes and to investigate the feasibility of testing substances on proarrhythmic properties with this system. Effects due to repolarisationblock caused by blocking of hERG-channels (human ether-a-go-go related gene) were the main focus, since it is a common adverse drug reaction that can lead to ventricular tachycardias of the torsades de pointe type. Since the proarrhythmic potential of new Substances cannot be completely fathomed with the preclinical tests available, an in addition torsades de pointe arrhythmias are a rare event, this cardiotoxic side effect has only been recognised in clinical use in several substances in the past decade. The necessary withdrawal from the market after deaths caused by these substances (e.g. cisapride, terfenadine, sparfloxacine, etc.) still represents a main problem in drug development. Improved preclinical test-panels, especially those based on human cardiomyocytes, might contribute to a solution.

Human embryonic stem cells were expanded in vitro and protocols for the generation of embryoid bodies and for highly efficient cardiac differentiation were established and modified. The protocol for differentiation was based on three strictly timed stages, each containing a specific combination of growth factors like Activin A, BMP 4, FGF 2, DKK 1 and VEGF. An efficiency of more than 40% of α-actinin-positve cells in the differentiated population was reached, and 1 to 2 x 106 cells per run were obtained, which are high numbers in international comparison. Q-PCR analysis of gene-expression of specific markers during development of cardiomyocytes served as a control of differentiation. Due to the high yield of cardiomyocytes, engineered heart tissue could be generated from this population without further selection. Using a method, which was developed in the institute and is based on fibrin and silicon-posts, strip format EHTs were generated. Their spontaneous contractile activity could be video-optically measured in a custom built device in an automated manner. Using figure recognition, the contractions were measured and translated into force. Furthermore, the parameters frequency and both time and velocity of contraction and relaxation were calculated from this data, in order to precisely describe the contractility. The known proarrhythmic drugs quinidine, sertindole, cisapride, procainamide, E 4031, thioridazine, dofetilid and ibutilide lead to a concentration dependant decrease in relaxation velocity and regularity of contractions. For all substances tested, relevant concentrations were in the range of IC50 values found in hERG-channel assays. Furthermore, in all substances concentrations which lead to a reduction in velocity of relaxation were lower than concentrations, which influenced the beating pattern.

This shows that human EHTs are able to test substances on their proarrhythmic potential. In future drug development this system might be added to the test panel of preclinical cardiotoxicity screens, better characterizing substances before release on the market and reducing animal experiments.

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