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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54277
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5427/


Molekulare Charakterisierung humaner Spermatogonien

Molecular characterization of human spermatogonia

Kopylow, Kathrein von

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SWD-Schlagwörter: Spermatogenese
Freie Schlagwörter (Deutsch): Spermatogonien , spermatogoniale Stammzellen , FGFR3 , UTF1 , DMRT1 , KIT , EXOSC10
Freie Schlagwörter (Englisch): spermatogenesis , spermatogonia , spermatogonial stem cells , FGFR3 , UTF1, DMRT1 , KIT , EXOSC10
Basisklassifikation: 42.13 , 42.20 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Kirchhoff, Christiane (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 05.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Spermatogonien sind die frühesten Vorläuferzellen der Spermatiden im adulten männlichen Organismus. Sie umfassen eine adulte Population mit Stammzell-Eigenschaften. Diese bilden durch ständige Selbsterneuerung und Differenzierung den Ausgangspunkt für eine lebenslange Spermatogenese im erwachsenen männlichen Organismus.

Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden durch die Auswertung von Mikroarray-Daten und deren Validierung auf mRNA- und Proteinebene spermatogonienspezifische Gene identifiziert. Zusätzlich wurden mittels Immunhistochemie weitere Spermatogonien-Marker untersucht. Mit Immun-Mehrfachfärbungen wurden anschließend verschiedene Marker-Kombinationen getestet, um Erkenntnisse über den molekularen Phänotyp verschiedener Subpopulationen und über die bislang noch nicht identifizierten spermatogonialen Stammzellen zu gewinnen. Hierbei zeigte sich eine unerwartete Heterogenität der Spermatogonien in Bezug auf die exprimierten Marker und keine einfache Korrelation des molekularen Phänotyps mit der bereits in den 1960- und 1970er Jahren festgelegten morphologischen Zelltypisierung. Neben einer Vielzahl an koexprimierten bzw. überlappenden Markern wurden einige sich hinsichtlich ihrer Expression ausschließende Marker detektiert.
Als gute Kandidaten für die Subpopulation der adulten Stammzellen innerhalb der gesamten Spermatogonienpopulation wurden Zellen mit dem molekularen Phänotyp UTF1+/FGFR3+/DMRT1-/KIT- ermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern Argumente für UTF1 und FGFR3 als humane spermatogoniale Stammzellmarker: FGFR3 wurde niemals in proliferierenden Spermatogonien gefunden. Auch kam dieser Marker nicht zusammen mit DMRT1 vor. DMRT1 wurde als weitgehend mit dem Differenzierungsmarker KIT koexprimiert gefunden und könnte in der humanen Spermatogoniogenese funktionell eine ähnliche Rolle wie KIT spielen. UTF1 wurde kaum in differenzierenden (KIT+) Spermatogonien detektiert und war nur in seltenen Fällen als mit DMRT1 koexprimiert zu finden. Dagegen wurde FGFR3 in einer Subpopulation der UTF1+ Spermatogonien beobachtet. Untersuchungen an fetalem Testisgewebe zeigten außerdem, dass FGFR3 im humanen Hoden bereits von fetalen Keimzellen exprimiert wird.
Spermatogoniale Stammzellen sind näher an der Lamina propria gelegen bzw. sitzen dieser direkt auf. Hierbei handelt es sich um eine Subpopulation der spermatogonialen Zelltypen A dark und A pale. Hingegen stellen die B-Spermatogonien eine differenzierte Form der Spermatogonien dar. Diese nehmen innerhalb der Tubuli seminiferi eine von der Basallamina weiter entfernte Position ein. Die in dieser Arbeit identifizierten molekularen Marker FGFR3 und UTF1 wurden größtenteils in Zellen detektiert, die sich unmittelbar an der Lamina propria befinden, also in „früheren“, „undifferenzierteren“ Zellen. Dagegen wurden DMRT1 und KIT niemals in A dark-Spermatogonien detektiert, aber oftmals in Zellen, die weiter von der Basallamina entfernt lokalisiert waren.

Die humanen A dark-Spermatogonien enthalten innerhalb des nukleären Chromatins eine vakuolenähnliche Struktur (Rarefaktionszone), von der man weiß, dass sie sich nicht mit DNA-Farbstoffen, jedoch schwach mit Eosin anfärben lässt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte der A dark-„Vakuole“ erstmalig eine Substanz, das Protein EXOSC10, zugeordnet werden. Dieses Protein stellt eine bekannte eukaryotische Exosomkomponente dar. Für die A dark-Spermatogonien könnte dies bedeuten, dass sich das nukleäre RNA-Exosom innerhalb der „vakuolen“-ähnlichen Struktur dieses Zelltyps befindet. Andererseits könnte die A dark-„Vakuole“ auch ein Speicherort für das Protein EXOSC10 sein. Gleichzeitig deutete sich ein funktioneller Zusammenhang des EXOSC10-Proteins mit der Umwandlung von ruhenden in proliferierende Spermatogonien an.

Aufgrund der klonalen Vermehrung sollten „undifferenziertere“ Spermatogonien in kleinen Klonen und „differenzierte“ auch in größeren Klonen vorkommen. Die Tatsache, dass FGFR3 in der whole mount-Analyse in kleineren Zellklonen detektiert wurde, unterstützt die oben aufgeführte Argumentation hinsichtlich einer potentiellen Stammzellfunktion dieses Proteins. Hingegen wurde der Differenzierungsmarker KIT auch in größeren Zellklonen, also „späteren“ Entwicklungsstadien von Spermatogonien, beobachtet.

Der im Rahmen dieser Studie detektierte spermatogoniale Oberflächenmarker FGFR3 diente deshalb abschließend zur Isolierung der FGFR3-positiven spermatogonialen Subpopulation. Hiermit wurde die Grundlage für die Kultivierung dieser Zellpopulation gelegt.
Kurzfassung auf Englisch: Spermatogonia as the earliest precursors of spermatids in the male adult contain a cell population with stem cell characteristics. Due to the ability for self renewal and differentiation, this cell population forms the basis for life-long spermatogenesis.

In this thesis, data from microarray analysis, real-time RT-PCR and immunohistochemistry were employed to detect spermatogonia-specific genes. Additionally, further markers for spermatogonia were examined by immunohistochemistry. Double and triple immunofluorescence staining with different marker combinations revealed an unexpected heterogeneity of the spermatogonial cells in terms of marker expression. No simple correlation with earlier morphological charactarizations of the cells could be confirmed. Besides a multitude of coexpressed respectively overlapping markers, some markers were detected which behaved mutually exclusive.

UTF1+/FGFR3+/DMRT1-/KIT- cells were identified as good candidates for the subpopulation of adult stem cells within the whole spermatogonial cell population. Arguments that UTF1 and FGFR3 constitute human spermatogonial stem cell markers are: FGFR3 was never present in proliferating spermatogonia and never coexpressed with DMRT1. To a large extent, DMRT1 was detected together with KIT, a marker for differentiation of spermatogonial cells, suggesting a similar function. UTF1 was barely expressed in differentiating (KIT+) or DMRT1+ spermatogonia. FGFR3 expression was encountered in a subpopulation of UTF1+ spermatogonia. Examination of fetal testis tissue displayed FGFR3 expression in human testis already during fetal stage.

Spermatogonial stem cells that comprise a subpopulation of the spermatogonial types A dark and A pale are located in direct contact to the basement membrane of the testicular seminiferous tubules. Type B spermatogonia, a further, differentiating spermatogonial subtype exhibit a more central location within the seminiferous tubule. The identified stem cell markers FGFR3 and UTF1 were predominantly detected in cells residing directly at the basement membrane, presumably “early”, “undifferentiated” cells. Contrasting this, DMRT1 and KIT were never observed in A dark spermatogonia, but largely in cells distant to the basement membrane.

Human A dark spermatogonia contain a vacuole-like structure inside their nuclear chromatin (region of rarefaction) which is faintly stainable with eosin. In this thesis, the eukaryotic exosome protein EXOSC10 could be identified within this structure. For A dark spermatogonia, this result could implicate the presence of the nuclear RNA-exosome in the vacuole. Alternatively, the A dark vacuole could provide a storage compartment for the EXOSC10 protein. These results point to a putative connection of the protein with the transformation of quiescent to proliferating cells.

Based on clonal expansion theory, “undifferentiated” spermatogonia should appear in small cell clones in contrast to “differentiated” spermatogonia featuring larger cell clones. Detecting FGFR3 in smaller cell clones by whole mount approaches supports a potential stem cell function of the protein. On the other hand, the differentiation marker KIT was also observed in “later” stages of spermatogonial development.

To isolate a FGFR3+ subpopulation, magnetic-activated cell sorting using FGFR3 as a surface marker was performed. This is the prerequisite for cultivation of this cell population.

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