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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54411
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5441/


Hypertrophic cardiomyopathy: Development of new molecular strategies for mutation analysis and therapy

Hypertrophe Kardiomyopathie: Entwicklung neuer molekularer Techniken zur Analyse von Mutationen und als Therapiemöglichkeit

Gedicke, Christina

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SWD-Schlagwörter: Herzhypertrophie , Gentherapie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Mutationsanalyse , Exon-skipping
Freie Schlagwörter (Englisch): Mutation analysis , Exon-skipping
Basisklassifikation: 44.99 , 44.52 , 44.38
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Eschenhagen, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 08.12.2011
Kurzfassung auf Englisch: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most frequent inherited cardiac disease and lacks effective treatment. It is commonly caused by mutations in the MYBPC3 gene encoding cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C). About 61% of MYBPC3 mutations are frameshift or nonsense mutations, which are expected to produce C-terminal truncated proteins. However, these proteins were undetectable in myocardial tissue of HCM patients or after adenoviral gene transfer in cardiac myocytes. The absence of detection suggested that aberrant mRNAs or proteins are highly unstable and degraded by NMD and/or the UPS. This may result in cMyBP-C haploinsufficiency, which is assumed to cause HCM. The evaluation of expression of human mutations is restricted by difficulties to access human tissue samples or to develop mouse models. Therefore the first goal of this study was to establish a cell-based system in HEK293 cells to analyse the expression of MYBPC3 mutations. We focused on two mutations that result in C-terminal truncated cMyBP-C proteins, which, when stabilized by specific drugs still contain the important functional domains required for sarcomeric incorporation. The major findings of the first part were: modified HEK293 cells stably expressing human MYBPC3 minigenes i) allow study of the expression of mutations at the level of mRNA and ii) reproduce data obtained in humans at the mRNA level. This provides the first evidence that stable HEK293 cells can be used as a cell-based system for screening the expression of human MYBPC3 mutations.
The second part of the study was based on a targeted Mybpc3-knock-in (KI) mouse model, which develops left ventricular hypertrophy. KI mice carry a homozygous G>A transition on the last nucleotide of exon 6, which results in 3 different mRNAs: one missense, one nonsense lacking exon 6, and one lacking exon 6 and containing part of intron 8. The goal was to evaluate the feasibility and efficiency of antisense oligoribonucleotides (AONs) to remove the mutated exon in KI cardiac myocytes by skipping both exons 5 and 6 and thereby force the expression of a newly-discovered spliced isoform variant-4, which is predicted to be functional. Two modified AONs were designed to target exonic splicing enhancer sequences in exon 5 (AON-5) and exon 6 (AON-6). Isolated and cultivated cardiac myocytes from wild-type-(WT) and KI mice were subsequently treated with AONs for ≥8 day. The major findings of the study were: i) Cy3-tagged AON-5 exhibited both a nuclear and cytosolic localisation, suggesting that AONs can enter the cells and may target pre-mRNAs, ii) AONs induced skipping of the corresponding exons in wild-type- and KI cardiac myocytes and iii) the levels of variant-4 mRNA and protein were higher in AON-treated than scram- or mock-transfected cells. This part provides the first proof-of-concept that the exon-skipping strategy works in Mybpc3-KI cells and therefore can be envisioned to be a functional in vivo approach to remove mutated exons in the context of HCM.

Kurzfassung auf Deutsch: Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) stellt die am häufigsten auftretende vererbte Herzerkrankung dar, für die es bislang jedoch keine effektiven Behandlungsmöglichkeiten gibt. Eine der häufigsten Ursachen der HCM sind Mutationen im MYBPC3 Gen, das für das kardiale Myosin-bindende Protein C (cMyBP-C) kodiert. Bei etwa 61% der MYBPC3 Mutationen handelt es sich um frameshift oder nonsense Mutationen, die C-terminal verkürzte Proteine erwarten lassen. Dennoch konnten diese verkürzten Proteine nicht im Myokardgewebe von HCM-Patienten oder nach adenoviraler Überexpression in Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Grund für die fehlende Detektion ist der Abbau der sehr instabilen aberranten mRNS oder Proteine über das NMD und/oder UPS. Dies kann eine cMyBP-C Haploinsuffizienz bedingen, die vermutlich an der Entstehung der HCM beteiligt ist. Die Analyse der Expression humaner Mutationen ist aufgrund der Erschwernis, humane Gewebeproben zu erhalten oder Mausmodelle zu entwickeln, eingeschränkt. Das erste Ziel dieser Arbeit bestand daher in der Etablierung eines zellbasierten Systems in HEK293 Zellen, um die Expression von MYBPC3 Mutationen zu untersuchen. Der Fokus lag auf zwei Mutationen, die jeweils in C-terminal verkürzten cMyBP-C Proteinen resultieren und welche, wenn durch bestimmte Substanzen stabilisiert, die wichtigen funktionellen Proteindomänen besitzen, die für eine sarkomerische Integration notwendig sind. Die wichtigsten Ergebnisse des ersten Teiles waren: modifizierte HEK293 Zellen, die stabil humane MYBPC3-Minigene exprimieren, ermöglichten eine Untersuchung der Expression von Mutationen auf RNS-Ebene und die Reproduktion von Daten, die in Patienten erhoben wurden. Dies lieferte den ersten Beweis dafür, dass stabil exprimierende HEK293 Zellen als zellbasiertes System für die Untersuchung der Expression humaner MYBPC3 Mutationen genutzt werden können.
Der zweite Teil dieser Arbeit basierte auf einem Mybpc3-Knock-in (KI) Mausmodell, das eine linksventrikuläre Hypertrophie entwickelt. KI-Mäuse weisen am letzten Nukleotid des Exons 6 eine homozygote G>A Transition auf, die in drei verschiedenen mRNS resultiert: Einer missense mRNS, einer nonsense mRNS, die aus dem Überspringen des Exons 6 resultiert und einer mRNS, die aus dem Überspringen des Exons 6 resultiert, jedoch einen Teil des Introns 8 beibehält. Das Ziel dieses Teiles der Arbeit war es, die Durchführbarkeit und Effizienz von Antisense Oligoribonukleotiden (AON) hinsichtlich des Überspringens der Exons 5 und 6 in KI-Kardiomyozyten zu evaluieren, und somit die Expression der kürzlich entdeckten Spleißvariante (Variante-4) zu forcieren, die vermutlich funktionell ist. Zwei modifizierte AON wurden designt, die gegen exonische spleißverstärkende Sequenzen in Exon 5 (AON-5) und 6 (AON-6) gerichtet sind. Mit den AON wurden anschließend kultivierte, aus WT- und KI-Mäusen isolierte Kardiomyozyten für ≥8 Tage behandelt. Die wichtigsten Ergebnisse dieses Teiles waren: i) Die Transfektion mit dem Cy3-getaggten AON-5 zeigte eine nukleäre und cytosolische Lokalisation, einen Hinweis darauf gebend, dass AON in die Zellen gelangen und an der prä-mRNS wirken könnten, ii) AON induzierten das Überspringen der jeweiligen Exons in WT- und KI-Kardiomyozyten und iii) die Menge der mRNS und Proteine von Variante-4 war höher in AON-behandelten als in scram- oder mock-transfizierten Zellen. Dieser Teil der Arbeit lieferte den ersten Nachweis dafür, dass die exon-skipping-Methode in Mybpc3 KI-Zellen durchführbar ist und auch in vivo im Rahmen der HCM angewendet werden könnte, um das mutierte Exon zu entfernen.


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