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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54519
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5451/


Charakterisierung der sRNAs RybA und HB_428 unter Peroxid-Stress in Escherichia coli

Characterization of the sRNAs RybA and HB_428 under peroxide stress in Escherichia coli

Gerstle, Kirstin

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SWD-Schlagwörter: Small RNA , Escherichia coli , Oxidativer Stress
Basisklassifikation: 35.70 , 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 14.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Kleine nicht-codierende RNAs (sRNAs) spielen in Bakterien eine wichtige Rolle in der Anpassung an veränderte Umweltbedingungen oder in der Stressantwort. Sie regulieren in Antwort auf externe oder interne Stimuli die Genexpression auf post-transkriptioneller Ebene. Der Großteil der heute bekannten sRNAs agiert über Basenpaarung mit einer mRNA. Dies kann zu einer Aktivierung oder Inhibierung der Translation oder zu einer Änderung der Stabilität der mRNA führen. Dazu gibt es Beispiele für sRNAs, die durch Bindung an Proteine deren Aktivitäten beeinflussen.
In E. coli sind zurzeit ca. 80-100 sRNAs bekannt, wobei der Hälfte bis jetzt noch keine Funktion zugewiesen werden konnte. Des Weiteren wurden durch bioinformatische Methoden mehrere hundert sRNAs in E. coli und anderen Bakterienarten vorhergesagt. Die experimentelle Validierung wurde jedoch nur für einen kleinen Teil der vorhergesagten sRNAs durchgeführt.
Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der sRNA RybA und der vorhergesagten sRNA HB_428. Die Analyse der Expression von rybA mittels Northern-Blot unter verschiedenen Wachstumsbedingungen ergab, dass diese sRNA besonders stark unter Peroxid-Stress produziert wird. Für HB_428 konnte eine verstärkte Expression unter dieser Bedingung zuvor schon gezeigt werden.
Für beide RNAs wurden erfolgreich die Transkriptionsstartpunkte mittels primer extension bestimmt. Das 3ʼ-Ende der sRNA RybA wurde mittels 3ʼ-RACE bestimmt. Es resultierte eine Länge von 206 nt für RybA. Diese Form war unter Peroxid-Stress vorherrschend, unter stressfreien Bedingungen konnten größere RybA-Spezies detektiert werden. HB_428 trat in drei unterschiedlichen Spezies von ca. 120 nt, 210 nt und 320 nt auf.
Zur Target-Identifizierung wurde die Genexpression von sRNA-Knock-out-Mutanten mit E. coli K12 WT-Zellen durch den Einsatz von Microarrays verglichen. Im Fall der sRNA HB_428 konnten die Ergebnisse der Microarrays durch Northern-Blot Analysen nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse für RybA suggerierten eine duale Funktion der sRNA. Zum einen agierte sie als cis-codierte antisense RNA und reguliert die Expression von yliL, welches ein putatives Protein ohne bekannte Funktion codiert. Zum anderen konnte unter Peroxid-Stress eine Beteiligung an der Regulation der Genexpression von Schlüsselgenen der aromatischen Aminosäurebiosynthese mittels Northern-Blot gezeigt werden. In E. coli K12 Wildtyp-Zellen wird die Expression dieser Gene unter Peroxid-Stress inhibiert. Der Knock-out von RybA führte zu einer verstärkten Expression unter dieser Bedingung. Es konnte gezeigt werden, dass die Regulation von dem Transkriptionsregulator TyrR abhängig ist. Das yliL-Gen spielt dabei keine Rolle.
Die Aufklärung des Mechanismus und die Bedeutung der Regulation der Aminosäurebiosynthese unter Peroxid-Stress durch die sRNA RybA bietet Stoff für zukünftige Experimente und verspricht weitere Einsichten in die Abwehr von Bakterien gegen oxidativen Stress.
Kurzfassung auf Englisch: Small non-coding RNAs (sRNAs) were found in all bacterial species investigated so far. They are mainly involved in the adaption to changes of environmental conditions and in stress response. Predominantly they do so by regulating gene expression at the post-transcriptional level via base-pairing with mRNAs. Outcomes of these base-pairings include activation or repression of translation and/or de- or stabilization of the mRNA. In addition there are few examples of sRNAs, which interact with a protein by mimicking other nucleic acids. This leads to inhibition of protein function.
To date approximately 80-100 sRNAs are known to be expressed in E. coli, but the function of only half of them has been determined. Moreover several hundreds were predicted with computational approaches in E. coli and other bacteria. The verification of the majority is still missing.
This thesis reports the characterization of the sRNA RybA and the predicted sRNA HB_428.
Using northern analysis it was demonstrated that rybA is primarily expressed under peroxide stress. Previous experiments for HB_428 have shown that this RNA was also expressed under this condition among others. Using primer extension the 5ʼ end of both sRNA was determined. 3ʼ- RACE experiments were successfully used to map the 3ʼ end of RybA under peroxide stress. Under peroxide stress RybA is 206 nt in size whereas larger species were observed under non-stress conditions. HB_428 appeared in three different species of approximately 120, 210 and 320 nt.
For target identification microarray analysis was used to compare gene expression of rybA and HB_428 deletion strains with E. coli wild type strain. For HB_428 no results of the microarray analysis could be confirmed by northern analysis. In the case of RybA two types of targets could be confirmed by northern analysis. First, RybA seems to act as a cis-encoded antisense RNA, which down regulates the expression of yliL, the gene which is encoded antisense to rybA. The function of YliL has to be elucidated since no information about this protein is available until now. However, yliL has no influence in the second regulation pathway of RybA.
Under peroxide stress RybA takes also part in the regulation of key genes involved in aromatic amino acid biosynthesis. In E. coli wild type cells the expression of these genes is repressed under peroxide stress. Deletion of RybA led to an up-regulation of gene expression under peroxide stress. It could be demonstrated that this regulation is dependent on the transcriptional regulator protein TyrR.
The mechanism of repression by RybA of the genes involved in the aromatic amino acid metabolism as well as its physiological role will be subject to further investigations.


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