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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54533
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5453/


Charakterisierung originärer IgE-Epitope der Majorallergene Bet v 1 und Phl p 5 durch Interaktionsanalysen mit rekombinanten humanen Antikörpern

IgE-epitope characterisation of the major allergens Bet v 1 and Phl p 5 by interaction analysis with recombinant human antibodies

Julia Hecker

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SWD-Schlagwörter: Epitop , Allergie , IgE , Antikörper , Allergen , SPR , Bet v 1 , Phl p 5 , Birke , Wiesenlieschgras , Epitopcharakterisierung
Basisklassifikation: 42.13 , 44.78 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 14.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit monoklonaler IgE-Antikörper konnte bislang nur eine geringe Anzahl von IgE-Epitopen klinisch relevanter Allergene identifiziert werden. Informationen über Allergenitäts-vermitteltende Strukturen oder Eigenschaften von Antigenen sind daher zum jetzigen Zeitpunkt auf molekularer Ebene kaum vorhanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden variable Domänen, die zuvor dem Immunrepertoire allergischer Spender entnommen und im Format scFv-tragender Phagen anhand ihrer Reaktivität mit den Allergenen Bet v 1a bzw. Phl p 5a selektiert worden waren, auf das Format bivalenter Antikörper der Allergie-relevanten Isotoypen IgE, IgG, IgA übertragen. Die Expression in eukaryotischen HEK293-Zellen sowie affinitätschromatographische Reinigungen führten zum Erhalt verwendbarer Mengen authentischer IgE-Antikörper. Durch prokaryotische Expressionen konnten die Allergene für Interaktionsanalysen mit den Antikörpern bereitgestellt werden und mithilfe SPR-spektroskopischer Messungen wurden Bindungskonstanten der Antikörper im ein- und zweistelligen nanomolaren Bereich ermittelt. Die in anderen Studien gezeigten außerordentlich hohen Affinitäten von IgE-Antikörpern, konnten hier nicht verzeichnet werden.
Die Funktionalität der Antikörper konnte durch Bindungen an die jeweiligen Fc-Rezeptoren nachgewiesen werden und macht diese so immunologischen und diagnostischen Testsystemen zugänglich. Die Bindung von IgE-Antikörpern an den FceRI sowie die Induktion der Signalkaskade konnten durch Degranulationsanalysen von Effektor-Zellen demonstriert werden. Hierbei konnte für den Phl p  5a-spezifischen IgE-Antikörper eine Allergen-induzierte Quervernetzung erreicht werden, was den in vivio-Mechanismus einer allergischen Soforttypreaktion reflektiert.
Mithilfe unterschiedliche Mutagenese-Strategien für die Expression der Allergene, anschließenden Immunblots und Visualisierungen der Allergene-Oberfläche konnten beide Epitope lokalisiert und essentielle, an der Bindung beteiligte Strukturelemente charakterisiert werden. Die Annahme, dass es sich bei IgE-Epitopen generell um flächige diskontinuirliche Epitope handelt konnte dabei nur bedingt demonstriert werden. Für beide Allergene konnten sequenzabhängige Strukturen identifiziert werden, die sich auf andere Proteine übertragen ließen. Ein einzelner Aminosäure-Austausch im Bet v 1a von Glu149, das in 95 % aller PR-10-Proteine konserviert vorliegt, führte zum Verlust der Reaktivität mit dem Antikörper. Bei dem Epitop des Phl p 5a-spezifischen Antikörpers handelt es sich um ein sterisch anspruchsvolles Helix-verbindendes Strukturelement, das ebenfalls Glutaminsäure-Reste trägt.
Die hier dargstellten originären allergenspezifischen IgE-, IgA- und IgG-Antikörper ermöglichten eine molekulare Analyse der Interaktion mit klinisch relevanten Majorallergenen sowie die Charakterisierung zweier authentischer B-Zell-Epitope. Diese Erkenntnisse sowie die Zugänglichkeit der Komponenten für weitere Anwendungen können einen Beitrag zum Verständnis der immunmodifizierenden Eigenschaften von Allergenen leisten. Ebenso können sie helfen, neue Ansätze zur Generierung verbesserter Wirkstoffe im Rahmen einer Immuntherapie zu entwickeln. Diese könnten erstmals auf der Kenntnis von IgE-Epitopen basieren, wodurch präzise defininierte Hypoallergene mit einer verminderten Anzahl an B-Zell Eptiotpen und gleichbleibender Immunogenität für eine sichere, hochwirksame allergenspezifische Immuntherapie entwickelt werden könnten.
Kurzfassung auf Englisch: The scarcity of monoclonal human IgE-antibodies with specificity for defined allergens is a bottleneck for the molecular characterisation of clinically relevant allergens and their epitopes. Thus identifying IgE-epitopes on a molecular level is currently a major challenge. Within the scope of this work it was possible to express variable antibody domains, which had been derived from the immunerepetoire of allergic patients and had been selected as scFv-displaying phages, with reactivity for the major pollen allergens Bet v 1a and Phl p 5a, as human IgE- IgG- and IgA-antibodies. Expression in eucaryotic HEK293-cells and purifications using different affinity chromatography techniques yielded in the acessibility of these genuine antibodies for further investigations. After procaryotic expression of the allergens, interaction analyses including initial SPR-spectroscopic measurements were carried out. Affinities with binding contstants in the medium nanomolar range could be detected which was contrary to very high affinities shown for other genuine IgE-antibodies.
It was possible to demonstrate the interaction of all antibody isotypes with their specific Fc-receptors, implicating functional integrity of the antibodies. This allows for their application in testsystems with diagnostic and immunulogcial backgrounds. Furthermore IgE-constructs binding to FceRI on the surface of effector cells could be crosslinked and induced degranulation of the cells and a mediator release. For the Phl p 5-specific antibody, allergen-induced degranulation was acchieved, which reflects the in vivo-mechanism of an immediate Type I hypersensitivity reaction.
Different strategies for allergen mutagenesis followed by immunoblotting and visualisation of the molecular surfaces were applied by which both epitopes could be localized and essential structures for the interaction with the antibodies were characterized. The hypothesis that IgE-epitopes share a common feature of being laminar and disconti­gous was not observed. For both antibody epitopes sequence-dependent structures of the allergens, which could be transferred to non-reactive proteins, were identified. In the case of Bet v 1 a single amino acid exchange of the highly conserved Glu149 residue completely abolished antibody-binding of the allergen.
The epitope of the Phl p 5-specific antibody was composed by a sterically demanding helix-turn-helix motif, which also carried negatively charged glutamic acid residues.
The allergen-specific IgG, IgE and IgA antibody isotypes enabled detailed analysis on the molecular interactions of allergens with genuine human antibodies. The strategy pursued here might be adapted to a variety of settings and may contribute to a broader access to molecular components in order to dissect the immunmodulating characteristics of allergens. Furthermore the delineation of B-cell epitopes provides information, that assists in improving the production of engineered allergen variants with reduced IgE-reactivity but conserved T cell-reactivity for efficient and safe allergen-specific
immunotherapy.

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