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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54561
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5456/


Isolierung und Charakterisierung von Transferrin-Glykoformen aus Blutproben von Seehunden mittels multidimensionaler chromatographischer Verfahren und molekül- und elementspezifischer massenspektrometrischer Detektion

Isolation and characterisation of transferrin glycoforms from blood samples of harbour seals using multidimensional chromatographic technics and molecule- and elementspecific mass spectrometic detection

Grebe, Mechthild

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SWD-Schlagwörter: Transferrin , Eisenion <Eisen(III)-ion> , ICP-Massenspektrometrie , Seehund , Kohlenhydratmangel-Transferrin ,
Freie Schlagwörter (Deutsch): eisenspezifische Detektion , Massenspektrometie , Isotopenverdünnung , Akut Phase Protein
Freie Schlagwörter (Englisch): ICP-mass spectrometry , iron specific detection , transferrin , harbour seal , acute phase protein
Basisklassifikation: 35.26
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Broekaert, Jose A. C. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 28.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 20.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Zur Bewertung des Ökosystems Wattenmeer wird der Seehund (Phoca vitulina) als biologischer Indikator eingesetzt. Unter anderem wird der Gesundheitszustand einzelner Tiere untersucht, wozu verschiedene diagnostische Parameter benötigt werden.

Das Plasmaprotein Transferrin (Tf) ist das wichtigste Transportprotein für das essentielle Spurenelement Eisen und zählt zur Gruppe der diagnostisch relevanten Akut-Phase-Proteine. Die Zwei-Domänen-Struktur von Tf ist zwischen den verschiedenen Säugetierspezies konserviert. Pro Tf-Molekül werden zwei Fe3+‑Ionen gebunden, welche als natürliche Elementmarkierung zur Quantifizierung von Tf mittels elementspezifischer massenspektrometrischer Verfahren, wie z.B. induktiv gekoppelte Plasma Massenspektrometrie (ICP-MS) herangezogen werden.

Für Seehund-Tf existieren bisher keine Quantifizierungsmöglichkeiten. Antikörper für eine Quantifizierung über antikörperbasierende ELISA-Methoden sind nur für einzelne ausgewählte Tierarten verfügbar. Die Konzentrationsbestimmung von Tf über das gebundene Eisen ist jedoch unabhängig von den einzelnen Tierspezies durchführbar.

Um das Seehund-Tf näher zu charakterisieren und seine Eignung als Indikatorprotein zu überprüfen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Methode zur Isolierung von Tf aus Seehund-Blutproben entwickelt. Mit molekülspezifischen Methoden wie der 2D-Gelelektrophorese, MALDI-MS, ESI-MS und ESI-MS/MS wurde das Seehund-Tf charakterisiert und über Interspezies-Vergleiche eindeutig identifiziert. Abschließend wurde eine HPLC‑basierte Methode zur Auftrennung der einzelnen Seehund-Tf-Glykoformen entwickelt, deren Konzentration erstmalig über ihren Eisengehalt mittels ICP-MS quantifiziert wurde.

Das Seehund-Tf ist homolog zu Transferrinen anderer Säugetierspezies. Es ist ein Glykoprotein mit bis zu neun verschiedenen Glykoformen, die sich durch ihren Anteil an Sialinsäuren unterscheiden, welche für das Retentionsverhalten auf der Anionenaustauschersäule verantwortlich sind. Die experimentell ermittelte Masse der dominanten Glykoform beträgt 81,136 kDa.

Die Quantifizierung von Seehund-Tf erfolgte mittels zweier unabhängiger präziser ICP‑MS‑basierter Methoden. Zum einen wurde durch den Einsatz einer zweiten HPLC-Pumpe eine Gradientenkompensation erzielt und die Kalibrierung mittels Flussinjektion vorgenommen. Der zweite Ansatz zur Quantifizierung von Seehund-Tf erfolgte über die Isotopenverdünnungs-ICP-MS.

Zum ersten Mal wurden Referenzbereiche (5 ‑ 95 % Perzentil) für die Tf-Konzentrationen als Summe der einzelnen Tf-Glykoformen von wildlebenden Seehunden aus der deutschen Nordsee experimentell bestimmt. Der Referenzbereich für Tf weiblicher Seehunde liegt mit 1,93 ‑ 2,74 g/L leicht höher als für die Männchen mit 1,42 ‑ 2,35 g/L. Neben der Bestimmung der Tf-Konzentration können möglicherweise Unterschiede im Tf-Glykoformen-Muster als potentieller Biomarker genutzt werden. Das chromatographische Muster der Tf-Glykoformen kann in zwei verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Das Muster mit der dominanten Glykoform unterscheidet sich von dem mit vermehrt gering-sialinierten Glykoformen dem carbohydrate deficient transferrin. In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche ICP-MS-Methoden zur akkuraten und präzisen Quantifizierung von Tf-Glykoformen entwickelt, die Langzeit-Gesundheitsbeobachtungen von Seehunden ermöglichen. 

 
Kurzfassung auf Englisch: Harbour seals (Phoca vitulina) were used as bio-indicators for the assessment of the North Sea ecosystem. Amongst others the individual health status of the seals is determined by different parameters.

The plasma protein Transferrin (Tf) is important for the transport of the essential trace element iron in the blood of all mammals and it belongs to the group of diagnostically relevant acute phase proteins. Tf consists of two similar domains, whose structure is conserved between the different mammalian species. Two Fe3+ ions were bound per one Tf molecule. The iron was used as natural element tag for the quantification of Tf, via element specific mass spectrometry such as inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).  

Until now, the quantification of seal Tf is not possible, Antibodies using for antibody based methods are only available for selected animal species. However, the determination of the Tf concentration via the bound iron is independent of the animal species.

A HPLC-ICP-MS approach has been developed which allows the highly resolved separation and fractionation of up to nine different Tf glycoforms, as well as their sensitive and specific detection on the basis of their characteristic iron content. Molecule-specific detection techniques such as 2D gel electrophoresis, MALDI‑MS, ESI-MS and ESI-MS/MS were used as complementary techniques to unambiguously identify the isolated proteins as Tf via cross species protein identification and to further characterise the protein.

The different Tf glycoforms vary in their sialic acid content, which is responsible for the elution behaviour of the glycoforms during their ion exchange separation. Seal Tf is homolog to Tf of other mammalian species, the determined molecular mass of the dominant seal Tf glycoform is 81.136 kDa.

Two independent HPLC-ICP-MS approaches were developed for the sensitive and specific absolute quantification on the basis of the characteristic iron content of Tf. One method is based on the application of a reversed gradient sheath flow to compensate gradient related effects during the iron specific detection and a flow injection calibration. The second developed method based on isotope dilution analysis, which has been applied for the quantification of the separated Tf glycoforms.

For the first time it was possible to quantify a baseline reference range (5 ‑ 95 % percentile) of serum Tf for male (1.42 – 2.35 g L‑1) and female German North Sea seals (1.93 – 2.74 g L‑1). Beside the Tf concentration differences in the Tf glycoform pattern can be useful as potential biomarker. The chromatographic pattern can be separated in two groups, one with the dominant glycoform and several low abundant glycoforms and the other pattern with elevated levels of the low sialinated glycoforms, the carbohydrate deficient Tf (CDT).

In this study two accurate protein quantification methods were developed, which are urgently needed in particular when aiming on comparable long term investigations of the health status of marine mammals such as harbour seals.
 

 

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