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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54570
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5457/


Die Regulation des intrazellulären „low density lipoprotein receptor-related protein 1“-Transports durch Adapterproteine

Regulation of the intracellular low density lipoprotein receptor-related protein 1 transport by adaptor proteins

Hoffzimmer, Britta

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SWD-Schlagwörter: Lipoproteide
Freie Schlagwörter (Deutsch): LRP1, PID1, PTB-Adapterproteine , NPxY-Motiv , intrazellulärer Transport
Freie Schlagwörter (Englisch): LRP1, PID1, PTB adaptor proteins , NPxY motif , intracellular transport
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heeren, Jörg (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 21.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Anomalien im Lipoproteinstoffwechsel sind assoziiert mit der Entstehung von Atherosklerose und des metabolischen Syndroms. Die Aufnahme und die intrazelluläre Prozessierung von Lipoproteinen beeinflussen direkt den Plasmalipoproteinspiegel. Beide Prozesse werden vermittelt durch hepatische Lipoproteinrezeptoren wie dem „low density lipoprotein“ (LDL)-Rezeptor und dem „LDL receptor-related protein 1“ (LRP1). Das Phosphotyrosin-Bindungs (PTB)-Domäne-enthaltende Adapterprotein „autosomal recessive hypercholesterolemia“ (ARH) reguliert via Interaktion mit dem NPxY-Motiv (Asparagin-Prolin-x-Tyrosin, (x = beliebige Aminosäure)) der intrazellulären Domäne (IZD) des LDL-Rezeptors spezifisch die LDL-Rezeptor-vermittelte Aufnahme in der Leber. Mutationen im ARH-Gen führen folglich zu einer defekten Internalisierung des LDL-Rezeptors und verursachen autosomal rezessive Hypercholesterinämie. Allerdings beeinflusst ARH in Hepatozyten nicht die Funktion von LRP1. Es ist zudem nicht bekannt, welche Adapterproteine den intrazellulären LRP1-Transport, das heißt die Internalisierung, das „Recycling“ und die Sortierung des Rezeptors, regulieren.

Außer mit Triglycerid-reichen Lipoproteinen interagiert LRP1 mit mehr als 30 nicht-verwandten Liganden, was die Multifunktionalität von LRP1 bestätigt. LRP1 fungiert als Rezeptor sowohl in Endozytose- als auch in Signaltransduktionsprozessen. Die intrazelluläre Domäne von LRP1 weist zwei NPxY-Motive und ein YxxL-Motiv (Tyrosin-x-x-Leucin (x = beliebige Aminosäure)) auf. Das distale NPxY-Motiv und das YxxL-Motiv überlappen sich und bilden ein NPxYxxL-Doppelmotiv. Diese Tyrosin-enthaltenden Motive bieten in Abhängigkeit ihres Phosphorylierungsstatus Interaktionsstellen für viele spezifische Adapterproteine, die sowohl den intrazellulären Transport als auch die Multifunktionalität von LRP1 regulieren sollen. Dabei sollen die nicht-phosphorylierten NPxY-Motive den intrazellulären LRP1-Transport regulieren, während die phosphorylierten NPxY-Motive LRP1 in Signaltransduktionsprozesse involvieren sollen.

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob das neu-identifizierte PTB-Domäne-enthaltende LRP1-Adapterprotein „phosphotyrosine interaction domain-containing protein 1“ (PID1) in die Regulation des intrazellulären LRP1-Transports involviert ist. Dazu wurde zunächst die LRP1/PID1-Interaktion mithilfe von GST-„Pull-down“-Experimenten, Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz untersucht. Diese Interaktionsstudien zeigten, dass PID1 mit der LRP1-IZD sowohl „in vitro“ als auch „in vivo“ interagiert. Zusätzlich konnte mithilfe von „in vitro-Pull-down“-Experimenten mit rekombinanten Proteinen nach Mutation des proximalen NPxY-Motivs und des distalen NPxYxxL-Motivs der LRP1-IZD gezeigt werden, dass PID1 mit dem distalen NPxYxxL-Motiv interagiert. Dabei sind das Asparagin, der aromatische Ring des Tyrosins und das Leucin des NPxYxxL-Motivs der LRP1-IZD essentiell für die Interaktion mit PID1. Adapterproteine, die eine PTB-Domäne aufweisen, werden in zwei Gruppen eingeteilt: die Phosphotyrosin-abhängigen und die Phosphotyrosin-unabhängigen PTB-Adapterproteine. Es wurde daher ein Einfluss einer SRC-Kinase-vermittelten Tyrosin-Phosphorylierung des NPxYxxL-Motivs der LRP1-IZD auf die Interaktion mit PID1 untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die LRP1/PID1-Interaktion durch „in vitro“-Phosphorylierung inhibiert wird. Im Gegensatz zu vielen anderen Adapterproteinen wie ARH, interagiert PID1 spezifisch mit der LRP1-IZD und bindet nicht an die LDL-Rezeptor-IZD. Diese Daten weisen darauf hin, dass das YxxL-Motiv der LRP1-IZD, das in der LDL-Rezeptor-IZD nicht vorhanden ist, essentiell für die Interaktion mit PID1 ist.

Die Phosphotyrosin-unabhängige LRP1/PID1-Interaktion lieferte den ersten Hinweis, dass PID1 an der Regulation des intrazellulären LRP1-Transports beteiligt sein könnte. Der intrazelluläre LRP1-Transport wurde mithilfe von konfokaler „Laser-Scanning“-Mikroskopie nach lentiviral-vermitteltem „Knock-down“ von PID1 und als Kontrolle von ARH in der humanen Hepatomazelllinie HUH7 untersucht. Es besteht die Hypothese, dass sowohl neu-synthetisiertes LRP1 nach Verlassen des Golgi-Apparates als auch LRP1 nach der Endozytose vor dem Transport an die Zelloberfläche über ein „Recycling“-Kompartiment sortiert werden. In Hepatozyten ist LRP1 hauptsächlich in einem intrazellulären Kompartiment lokalisiert. Kolokalisierungsstudien in Wildtyp- und ARH-defizienten HUH7-Zellen zeigten, dass das LRP1-positive Kompartiment einem „Recycling“-Kompartiment entspricht. Ein „Knock-down“ von PID1 in HUH7-Zellen resultierte in einer veränderten zellulären LRP1-Lokalisation. LRP1 war nun in Vesikeln lokalisiert, die im gesamten Zytoplasma verteilt waren. Dabei kolokalisierten die LRP1-positiven Vesikel sowohl mit dem „Recycling“-Kompartiment als auch mit frühen Endosomen. Diese Daten zeigen, dass LRP1 zwar in Abwesenheit von PID1 über das „Recycling“-Kompartiment transportiert wird, allerdings nicht in diesem intrazellulären LRP1-„Pool“ zurückgehalten wird. PID1 könnte daher am „Recycling“-Kompartiment die Membrantranslokation von LRP1 verhindern, die durch exogene Stimuli induziert werden kann. Interessanterweise soll neu-synthetisierter LDL-Rezeptor am Golgi-Apparat direkt an die Zelloberfläche sortiert werden. Die Sortierung von Proteinen am Golgi-Apparat nach deren Biosynthese über ein „Recycling“-Kompartiment scheint demnach für manche Membranproteine eine obligatorische Station zu sein und könnte erklären, weshalb PID1 nicht mit dem LDL-Rezeptor interagiert. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Fehlsortierung von LRP1 nach „Knock-down“ von PID1 in HUH7-Zellen einen Einfluss auf die Funktion von LRP1 als Lipoproteinrezeptor hat. Die Abwesenheit von PID1 in HUH7-Zellen führte erstens zu einer kompensatorischen Hochregulation des LDL-Rezeptors und zweitens zu einer beeinträchtigten Aufnahme von Triglycerid-reichen Lipoproteinen nach Inhibition des LDL-Rezeptors.

LRP1 ist ein endozytischer Rezeptor, der in viele zelluläre Prozesse wie Signaltransduktion und Lipid-Homöostase involviert ist. Diese Arbeit zeigte, dass das neu-identifizierte Adapterprotein PID1 an das distale NPxYxxL-Motiv der LRP1-IZD bindet. Diese Interaktion ist für die hepatische Lokalisation und Funktion von LRP1 essentiell und könnte eine wichtige regulatorische Komponente darstellen, die die verschiedenen Funktionen von LRP1 kontrolliert.
Kurzfassung auf Englisch: Abnormalities in lipoprotein metabolism are associated with the development of atherosclerosis and the metabolic syndrome. The uptake and intracellular processing of lipoproteins directly influence the plasma lipoprotein levels and both processes are mediated by hepatic lipoprotein receptors such as the low density lipoprotein (LDL) receptor and the LDL receptor-related protein 1 (LRP1). It is well established that the phosphotyrosine-binding (PTB) domain containing adaptor protein autosomal recessive hypercholesterolemia (ARH) specifically regulates LDL receptor mediated endocytosis in the liver via its interaction with the single NPxY motif (asparagine-proline-x-tyrosine, (x = any amino acid)) of the intracellular domain (ICD) of the LDL receptor. Therefore, mutations in the ARH gene lead to defective internalization of the LDL receptor causing autosomal recessive hypercholesterolemia. The function of LRP1 in hepatocytes is not affected by ARH. It remains unclear which adaptor proteins participate in the intracellular LRP1 transport consisting of the internalisation, recycling and sorting of the receptor.

Next to triglyceride-rich lipoproteins, LRP1 can also bind to various other ligands indicating the multiple functions of LRP1. LRP1 is not only involved in endocytosis but also in signal transduction pathways. The ICD of LRP1 contains two NPxY motifs and a YxxL motif (tyrosine-x-x-leucine (x = any amino acid)). The distal NPxY motif is overlapping with the YxxL motif forming an NPxYxxL double motif. Depending on their phosphorylation status the tyrosine-based motifs of the LRP1-ICD are hypothesized to regulate both the intracellular transport and the different effects of LRP1 by interaction with specific adaptor proteins. Thereby, the unphosphorylated NPxY motifs might mediate the intracellular transport of LRP1 while the phosphorylated NPxY motifs are supposed to involve LRP1 in signal transduction processes.

The aim of this work was to investigate whether the newly identified PTB domain containing LRP1 adaptor protein phosphotyrosine interaction domain-containing protein 1 (PID1) is involved in the regulation of the intracellular LRP1 transport. At first the interaction of LRP1 with PID1 was analyzed by GST pull down experiments, immunoprecipitation and immunofluorescence. These LRP1/PID1 interaction studies showed that PID1 interacts with the LRP1-ICD in vitro as well as in vivo. In addition, it was shown by in vitro pull down assays with recombinant proteins after mutation of the proximal NPxY motif and the distal NPxYxxL motif of LRP1-ICD that PID1 interacts with the distal NPxYxxL motif. Thereby, the asparagine, the aromatic ring of the tyrosine and the leucine of the NPxYxxL motif are essential for the interaction with PID1. PTB domain containing adaptor proteins are divided into two groups represented by phosphotyrosine-dependent and phosphotyrosine-independent PTB adaptor proteins. Therefore, the influence of an SRC kinase mediated tyrosine-phosphorylation of the NPxYxxL motif of the LRP1-ICD on the interaction with PID1 was analyzed and showed that the LRP1/PID1 interaction is inhibited by in vitro phosphorylation. In contrast to many other adaptor proteins like ARH, PID1 specifically interacts with LRP1-ICD and does not interact with the LDL receptor-ICD indicating that the YxxL motif of LRP1-ICD missed in the LDL receptor-ICD is essential for the interaction with PID1.

The phosphotyrosine-independent LRP1/PID1 interaction gave the first hint that PID1 could participate in the regulation of intracellular LRP1 transport. The intracellular transport of LRP1 was analyzed by confocal laser scanning microscopy after lentiviral mediated knock down of PID1 and as a control of ARH in the human hepatoma cell line HUH7. It is hypothesized that both newly synthesized LRP1 after leaving the golgi apparatus and LRP1 after endocytosis may traverse a recycling compartment before arriving at the cell membrane. In hepatocytes, LRP1 is predominantly located in an intracellular compartment. Colocalization studies in wild type and ARH deficient human hepatoma cells showed that the LRP1 positive compartment corresponds to a recycling compartment. Knock down of PID1 resulted in an altered cellular localisation of LRP1 in human hepatoma cells. LRP1 was located in vesicles which were distributed in the cytosol. The LRP1 positive vesicles colocalized with both the recycling compartment and early endosomes. These data show that LRP1 is able to traverse the recycling compartment in absence of PID1 but it cannot be stored in this compartment. Therefore, PID1 may prevent at the recycling compartment the translocation of LRP1 to the plasma membrane which can be induced by exogenous stimuli. Interestingly newly synthesized LDL receptor is directly transported to the cell surface after leaving the golgi apparatus. Therefore, for some membrane proteins biosynthetic trafficking through a recycling compartment seems to be an obligate station and may explain why PID1 does not interact with the LDL receptor. Moreover the missorting of LRP1 after knock down of PID1 has an influence on the function of LRP1 as a lipoprotein receptor in human hepatoma cells. The knock down of PID1 firstly resulted in a compensatory upregulation of the LDL receptor and secondly in an impaired uptake of triglyceride-rich lipoproteins after inhibition of the LDL receptor.

LRP1 is an endocytic receptor involved in several cellular processes, including intracellular signaling and lipid homeostasis. This work demonstrated that the newly identified adaptor protein PID1 binds to the distal NPxYxxL motif of the LRP1-ICD. This interaction is essential for hepatic LRP1 localization and function and might be an important regulatory component to control the diverse functions of LRP1.


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