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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54594
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5459/


Mutiertes p53 als globaler transkriptioneller Ko-Faktor

Quante, Timo

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Basisklassifikation: 35.70 , 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 21.12.2011
Kurzfassung auf Deutsch: Tumorentstehung und Progression folgen einem mehrstufigen Evolutionsprozess, in dessen Verlauf Zellklone selektioniert werden, die einen Wachstumsvorteil gegenüber benachbarten, normalen Zellen besitzen. Dabei kommt es zu einer Akkumulation genetischer und epigenetischer Veränderungen, in deren Folge sich Transkriptionsmuster ausbilden, die einen für den Tumor vorteilhaften Phänotyp generieren. Der Tumorsuppressor p53 ist entscheidend an der Aufrechterhaltung der genomischen Integrität beteiligt. Im Mittelpunkt eines Netzwerkes von Schadenssignalwegen wirkt p53 als Detektor für DNA-Schäden und Bedingungen, die eine Gefahr für DNA-Schäden bergen. Durch Induktion von
Zellzyklusarrest und Reparatur der Schäden oder Eliminierung der Zelle aus dem Zellverband verhindert p53 die Ausbildung eines „Tumorzell-Transkriptoms“. Die Tatsache, dass ein Großteil von Tumoren p53-Mutationen oder Defekte innerhalb des p53-Netzwerkes aufweist, unterstreicht die große Bedeutung von p53 als Tumorsuppressor. Im Gegensatz zu anderen Tumorsuppressoren, die häufig durch Deletionen und nonsense-Mutationen deaktiviert werden, treten bei p53 überwiegend missense-Mutationen auf, die die Expression eines vollständigen mutp53-Proteins mit einem Aminosäureaustausch zur Folge haben, das die sequenzspezifische DNA-Bindung von wtp53 verloren hat. Neben dem Verlust der Schutzfunktion durch wtp53 sind für mutp53 zahlreiche tumorfördernde Eigenschaften (GOF) wie eine verstärkte Proliferation, unbegrenztes Replikationspotential, erhöhte Resistenz gegen Chemotherapeutika und Apoptose, Störung der Differenzierung, Förderung der Angiogenese, größere Motilität und Invasion, sowie erhöhte Metastasierung beschrieben. Viele der GOFEffekte beruhen auf transkriptioneller Regulation durch mutp53 und für verschiedenste Gene
konnte eine Assoziation von mutp53 mit deren Promotorregionen nachgewiesen werden. Allerdings sind die mutp53-regulierten Gene in unterschiedlichen Zelllinien und Tumoren sehr heterogen, und aufgrund der fehlenden sequenzspezifischen DNA-Bindung sind die genauen molekularen Grundlagen der transkriptionellen Regulation durch mutp53 trotz zahlreicher Studien bisher nur wenig verstanden. Zurzeit herrschen zwei Modelle vor, die
transkriptionelle Regulation durch mutp53 beschreiben. Einerseits kann mutp53 durch Interaktionen mit Transkriptionsfaktoren an die Promotoren von deren Zielgenen rekrutiert werden und die Transkription dieser Gene beeinflussen. Andererseits hat mutp53 die Eigenschaft, strukturabhängig an DNA zu binden, die in nicht-B-Konformation vorliegt und häufig in repetitiven Bereichen zu finden ist. Über diese Bindung könnte mutp53 kontextabhängig die Genexpression modulieren. Während das erste Modell einem deterministischen Ansatz entspricht, demnach mutp53 durch Interaktionen mit einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren ein definiertes Set von Zielgenen reguliert, bietet das Modell der direkten DNA-Bindung an repetitive Bereiche einen Mechanismus für eine globale transkriptionelle Regulation durch mutp53, die der beobachteten Heterogenität und Zelltyp-Abhängigkeit der mutp53-Zielgene Rechnung trägt. In dieser Arbeit wurde das Modell untersucht, das von mutp53 als einem globalen, kontextabhängigen transkriptionellen Modulator ausgeht. Zunächst wurden die Effekte eines transienten mutp53-knockdowns auf die Transkription in einem Tumorzellsystem (U251) mit endogenem mutp53 analysiert. Dabei
zeigte sich bereits innerhalb eines Zellsystems eine hohe Variabilität der transkriptionellen Regulation durch mutp53. Chromatin-Immunopräzipitations-Experimente zeigten, dass sich nahezu alle mutp53-regulierten Gene in U251 Zellen in einem aktiven Grundstatus befinden.
Mutp53 assoziiert mit einer Vielzahl von Promotorregionen, sowohl regulierter als auch unregulierter Gene. Die mutp53-Bindestellen sind G/C-reich, überlappen zu einem großen Teil mit CpG-Inseln und können mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht-B-DNAKonformationen annehmen. Basierend auf diesen Daten wird ein Modell vorgeschlagen, in dem mutp53 durch Bindung an G/C-reiche regulatorische Regionen die Transkription einer Vielzahl von Genen stimulus- und zelltypspezifisch modulieren kann. Als globaler Ko-Faktor hält mutp53 die transkriptionelle Kompetenz dieser Gene aufrecht und schafft transkriptionelle Plastizität, die die Anpassungsfähigkeit von Tumorzellen erhöht.
Kurzfassung auf Englisch: Tumor initiation and progression is a multistage process of clonal evolution selecting for cell clones equipped with a growth advantage. Accumulated genetic and epigenetic changes generate transcription profiles that result in a phenotype favorable for tumor growth. The tumor suppressor p53 plays a crucial role in maintaining genomic integrity. As a central effector of a network of damage response pathways p53 serves as a detector of DNA-damage and various stress signals. By inducing cell cycle arrest and repair processes or by eliminating the damaged cell, p53 prevents the creation of a “tumor cell transcriptome”. Underscoring the importance of its functions, p53 itself or components of the p53 network are mutated in a large number of tumors. In contrast to other tumor suppressors that are commonly inactivated by deletions or nonsense mutations, the majority of p53-mutations are missense point mutations that result in the expression of a full-length protein with an amino acid exchange (mutp53) that has lost sequence specific DNA-binding. In addition to the loss of wtp53 functions, expression of mutp53 confers several oncogenic functions like increased proliferation, unlimited replication potential, enhanced resistance to chemotherapy and apoptosis, impaired differentiation, promotion of angiogenesis and enhanced motility,
invasion and metastasis to tumor cells, summarized under the term “gain of function” (GOF). Many GOF effects rely on the ability of mutp53 to regulate transcription and an association of mutp53 with numerous target gene promoters has been demonstrated. However, there is considerable heterogeneity among mutp53 target genes between cell lines and tumors, and, owing to the loss of sequence specific DNA-binding, the exact molecular mechanisms of transcriptional regulation by mutp53 are still poorly understood despite numerous studies. Two models of transcriptional regulation by mutp53 are currently considered. First, mutp53 can be recruited to and regulate transcription of genes by interacting with several transcription factors. Secondly, mutp53 can influence transcription by binding, in a structure selective manner, to DNA that adopts non-B-conformation, a feature that can be found mostly in repetitive regions. The first model reflects a deterministic approach according to which mutp53 has a defined set of target genes resulting from interactions with distinct transcription factors. In contrast, direct DNA-binding of mutp53 to repetitive regions suggests a global
mechanism of transcriptional regulation that can account for the observed heterogeneity and cell type dependency of mutp53 effects. In this study the model of mutp53 as a global, context-dependent transcriptional modulator was investigated. The effects of transient mutp53-depletion on transcription were analyzed in a tumor cell system with endogenous mutp53 expression (U251). Global expression analysis displayed large variability of transcriptional regulation by mutp53 already in this cellular system. Chromatin-immunoprecipitation experiments revealed that most promoters of
mutp53-regulated genes in U251 cells exhibit characteristics of active promoters. Furthermore mutp53 is associated with a large number of promoter regions including promoters of those genes that are regulated by mutp53 and others that are not regulated. Mutp53 binding sites are
G/C-rich, a large number coincides with CpG-islands, and the bound regions are prone to adopt non-B-DNA-conformations. This data provides the basis for a model according to which mutp53 can modulate transcription of a large number of genes in a cell type- and stimulus-specific manner by binding to G/C-rich regulatory regions. As a global co-factor mutp53 maintains transcriptional competence and generates transcriptional plasticity that increases the adaptability of tumor cells.

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