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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54723
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2011/5472/


X-ray structure analysis of a pathogenic bacterial protease from Stenotrophomonas maltophilia towards drug discovery

Röntgenstrukturanalyse eines pathogenen Bakterien Protease aus Stenotrophomonas maltophilia Richtung der Wirkstoffforschung

Negm, Amr

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Freie Schlagwörter (Deutsch): StmPr1 , Stenotrophomonas maltophilia , protease
Freie Schlagwörter (Englisch): StmPr1 , Stenotrophomonas maltophilia , protease
Basisklassifikation: 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Betzel, Christian (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 29.12.2011
Kurzfassung auf Englisch: Most pathogenic bacteria are known to produce extracellular proteases that can attack and degrade host tissues and therefore are mainly responsible for the proceeding pathogenesis caused by the bacteria. Stenotrophomonas maltophilia is one of those bacteria, which cause pulmonary inflammation. 4.5% of nosocomial pneumonia in patients in intensive care units and 6% of ventilar pneumonias are linked these days to these bacteria. The pathogen is multi-drug resistant, thus, evading conventional antibiotic therapy. Particularly, in immune-suppressed patients this bacteria cause severe infections associated with tissue lesions such as pulmonary hemorrhage. These observations strongly suggest that bacterial proteases are damaging the infected tissue area. Indeed, it was shown before that S. maltophilia produces two extracellular proteases with broad specificity. The associated major protease gene, termed StmPr1, codes for a 63 kDa precursor, which is processed to a mature protein of 47 kDa. The enzyme is an alkaline serine protease, which, by sequence homology and enzymatic properties, can be classified as a new member of the subtilisin family (subtilisin-like protease). However, the molecular size is substantial larger compared to so far known subtilisins, and also the 3D-structure is suggesting a new fold within the family of subtilisin proteases. The high resolution X-ray structure of the Stenotrophomonas maltophilia protease StmPr1 was determined and refined to a final R-factor of 15.4% and R-free of 16.7 %. The protein was crystallized by the hanging drop method using 1.8 M ammonium sulphate as a precipitant. Crystals diffracted to 1.4 Å resolution applying synchrotron radiation with unit-cell parameters of a = 60.17, b = 86.10 and c = 131.40 Å corresponding to the orthorhombic space group C2221 with one molecule in the asymmetric unit. The overall folding of the enzyme is quite similar to that observed for subtilisins. The protein is rich in acidic amino acids and contains four cysteine residues forming two intra-chain disulfide bridges. In terms of structure-based drug discovery investigations co-crystallization of StmPr1 with the peptide aldehyde inhibitors, chymostatin and leupeptin, was performed and the high resolution structures of the complexes were analyzed. The peptide aldehydes react with the active site residues of StmPr1 forming a complex with a hemiacetal conformation between the C-terminal L-phenylalanine residue of chymostatin or the L-arginine residue of leupeptin and the hydroxyl group of the catalytic Ser-289 of StmPr1. Further, high-throughput screening (HTS) was applied using the compounds of the ENZO and ChemBioNet libraries to identify further inhibitors. For all investigation the protein was produced in mg quantities in E. coli, and an enzyme assay was established to check inhibitory effects suitable for the robot-based screening procedure applied. Several additional potential inhibitors could be identified with IC50 values < 10 μM. One of them is bortezomib, applied already in antic-cancer therapy, inhibiting effectively the proteasome and showing an IC50 value of 0.3 μM, towards the StmPr1 protease. Bortezomib was also co-crystallized and the structure was analyzed in the presented thesis. The structure of the StmPr1 protease reveals some differences in the architecture of the active site compared to the classic subtilisins and other serine proteases. In principle these differences can be utilized for the development of specific drugs. The screening experiments performed combined with the structures analyzed and the results obtained will support future drug discovery investigations. Preliminary cell culture experiments showed already that the S. maltophilia protease, which is able to destroy human lung cells can be inhibited in presence of bortezomib. Beside the summarized screening approaches, a peptide from the Agkistrodon bilineatus venom showing inhibitory activity towards StmPr1 was analyzed in complex with StmPr1. The peptide was provided in terms of an internal collaboration.
Future biological experiments using cell cultures and animal models will have to show whether the inhibitors identified so far may serve as lead compounds for drug discovery.
Kurzfassung auf Deutsch: Einige pathogene Bakterien produzieren extrazelluläre Proteasen, welche humanes Wirtsgewebe angreifen und abbauen können und damit auch lebensbedrohliche Effekte verursachen. Das grammnegative und multiresitente Bakterium Stenotrophomonas maltophilia ist eines dieser Bakterien. S. maltophilia verursacht insbesondere bei Patienten deren Immunsystem durch andere Krankheiten oder Infektionen geschwächt ist schwere Lungenentzündungen mit Gewebeschäden die auch zu Lungenblutungen führen. Diese Beobachtungen lassen auf bakterielle Proteasen schliessen, die für die nachhaltige Beschädigung des infizierten Gewebes verantwortlich sind. Im Rahmen vorhergehender Arbeiten konnte für S. maltophilia gezeigt werden, dass zwei extrazelluläre und weitgehend unspezifische Proteasen diese Aktivität vermitteln. Ein entsprechendes Protease-Gene wurde StmPr1 genannt. Es kodiert ein 63 kDa grosses Vorläuferprotein, welches in einem Enzym mit 47 kaD Molekulargewicht resultiert. Es handelt sich hierbei um eine alkalische Serinprotease, die anhand von Sequenzhomologie und enzymatischer Aktivität der Familie der Subtilasen (Subtilisin-ähnliche Proteasen) zugeordnet wurde. Das Molekulargewicht ist im Vergleich zu bisher bekannten Subtilisinen um ca. 30% grösser. Das Protein wurde in für Röntgenstrukturanalysen erforderlichen Mengen exprimiert, aufgereinigt und folgend über Dampfdiffusion nach der Methode des hängenden Tropfen kristallisiert. Die Zellparameter ergaben sich zu: a = 60,17, b = 86,10 und c = 131,40 Å. Die Raumgruppe wurde zu C2221 mit einem Molekül in der asymmetrischen Einheit bestimmt. Die Röntgenstruktur der Stenotrophomonas maltophilia Protease StmPr1 wurde zu 1.4Å Auflösung ermittelt und zu einem R-Faktor von 15,4% und Rfree von 16,7% verfeinert. Die 3D Struktur zeigt die für Subtilisine bekannte Grundfaltung mit einer zusätzlichen Loopstruktur an der Oberfläche des Enzyms. Das Protein ist reich an sauren Aminosäuren und enthält vier Cys-Reste die zwei Disulfidbrücken ausbilden.
Um potentielle Inhibitoren gegen diese StmPr1 Protease zu identifizieren und strukturbasiertes Wirkstoffdesign zu unterstützen, wurde StmPr1 mit dem Peptid-Aldehyd-Inhibitoren Chymostatin und Leupeptin co-kristallisiert und Diffraktionsdaten unter Anwendung von Synchrotronstrahlung zu hoher Auflösung gesammelt. Die Komplexstrukturen zeigten, dass das C-terminale L-Phenylalanin des Chymostatin und der L-Arginin-Rest des Leupeptin die Hydroxyl-Gruppe des aktiven Ser289 koordinieren und das Enzym inhibieren.
Um weitere Inhibitoren zu identifizieren wurde ein Hochdurchsatz-Screening (HTS) mit der ENZO- als auch der ChemBioNet Compound Bibliothek durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde das Protein in ausreichenden Mengen in E. coli produziert und ein entsprechender Enzym-Assay etabliert. Mehrere potenzielle Inhibitoren mit IC50-Werten <20 uM wurden identifiziert. Einer dieser Inhibitoren ist Bortezomib mit einem IC50 Wert von 0, 4 uM, ein Wirkstoff der bereits in der Krebstherapie eingesetzt wird und dort das Proteasome effektiv inhibiert. Um die strukturellen Details der Inhibierung zu analysieren, wurde der StmPr1 Komplex mit Brotezomib kristallisiert und die Struktur analysiert. Die erhaltenen Strukturdaten können für die Entwicklung von spezifischen Hemmstoffen genutzt werden.
Im Rahmen einer Zusammenarbeit innerhalb der Arbeitsgruppe wurde auch ein Peptid aus dem Schlangengift der Schlange Agkistrodon bilineatus als potentieller StmPr1 Inhibitor identifiziert und eine Röntgenstrukturanalyse des Komplexes durchgeführt und damit ein weiterer Beitrag zum strukturbasierten Inhibitordesign erarbeitet.
Abschliessende Zellkultur-Experimente bestätigten, dass die Sekrete von S. maltophilia in der Lage sind menschliche Lungenzellen zu zerstören. Und erste Experimente in Gegenwart von Bortezomib zeigten, dass der Abbau der Lungenzellen substantiell gehemmt wird. Zukünftig geplante biologische Experimente mit Zellkulturen und Tiermodellen werden zeigen, ob die bisher identifizierten Inhibitoren als Leitstrukturen für weitere Wirkstoffentwicklung genutzt werden können, da für zukünftige Medikamentenentwicklung ausschliesslich Inhibitoren mit hoher Spezifität gegen die StmPr1 Protease engesetzt werden können.

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