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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-48933
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/4893/


Klonierung und funktionelle Analyse des Gens ZmPPR6 (Pentatricopeptide Repeat 6) aus einer Zea mays L. Körnermutante

Manavski, Nikolay

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Kornentwicklung , Mitochondrien , PPR-Protein , Protein-RNA-Interaktion , Mais
Freie Schlagwörter (Englisch): Kernel development , Mitochondria, PPR protein , Protein-RNA interaction , Maize
Basisklassifikation: 42.43 , 42.13 , 42.15
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Pflanzen (Botanik)
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Wienand, Udo (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 24.09.2010
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 13.12.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und molekulare Funktionsanalyse bis jetzt unbekannter, an der Kornentwicklung von Mais beteiligter Gene. Als Basis dafür diente eine Mutator-Transposon-induzierte Kollektion aus 60 Maiskörnermutanten, in denen die für den Mutanten-Phänotyp kausalen Gene durch ein im Rahmen des internationalen ERA-Net-Projekts MuExpress entwickeltes, cDNA-basiertes transposon tagging Verfahren identifiziert werden sollten.
Ein pentatricopeptide repeat (PPR) Protein kodierendes Gen, das ZmPPR6 genannt wurde, konnte durch die innovative transposon tagging Methode aus einer dieser Mutanten identifiziert bzw. kloniert werden. Ein Verlust der ZmPPR6-Funktion in der Maismutante zeigt einen schwerwiegenden Phänotyp, der sich durch kleine, geschrumpelte, keimungsunfähige Körner auszeichnet. Nähere histologische Untersuchungen mutierter Körner haben ergeben, dass die zmppr6-Mutation mit Veränderungen der basalen Transferzellen des Endosperms, einer starken Reduktion des Stärkegehaltes sowie Verzögerungen der Embryoentwicklung einhergeht. Durch umfassende Ko-Segregationsanalysen sowie einen Allel-Test konnte gezeigt werden, dass die phänotypischen Korndefekte der Mutante alleine durch die Mu-bedingte Mutation des ZmPPR6-Gens zustande kommen.
Das ZmPPR6 kodiert für ein 55 kDa Protein, das über 10 tandemartig angeordnete PPR-Motive und eine vorgeschaltete Signalsequenz für den Import in die Mitochondrien verfügt. Ein ähnlicher Phänotyp wurde in drei Arabidopsis-Mutantenlinien beobachtet, bei denen das homologe PPR6-Gen, AtPPR6, von T-DNA-Insertionen betroffen war. Durch eine heterologe Expression des ZmPPR6-Gens konnte die atppr6-Mutation vollständig komplementiert werden. Dies zeigt, dass der mutierte Phänotyp der Arabidopsis-Pflanzen alleine durch die T-DNA-Insertion bedingt war, und dass ZmPPR6 und AtPPR6 orthologe Gene sind.
Im Rahmen gewebe- und entwicklungsspezifischer Expressionsanalysen wurde eine insgesamt sehr schwache Expression des ZmPPR6 festgestellt. Das Gen war hauptsächlich im Korngewebe während der Frühentwicklung exprimiert, eine schwache Akkumulation des Transkripts wurde jedoch auch in vegetativem Gewebe beobachtet. Subzelluläre Lokalisationsstudien haben gezeigt, dass ZmPPR6-Protein in den Mitochondrien akkumuliert. Immunologische Untersuchungen belegten diese Lokalisation.
Höhere Pflanzen enthalten mehr als 450 kernkodierte PPR-Proteine, die in Organellen an bestimmte Ziel-RNAs sequenzspezifisch binden und posttranskriptionale Prozesse wie RNA-Editing, -Spleißen, -Restriktion, -Stabilität und Translation ermöglichen. Daher wurde zunächst der spezifische RNA-Ligand und die der RNA/ZmPPR6-Interaktion zugrundeliegende Funktion untersucht. Mittels einer Immunopräzipitation des ZmPPR6-mtRNA-Komplexes aus Mitochondrienproteinextrakt und anschließender RT-PCR wurde der 5‘ UTR der mRNA für das ribosomale Proten S3 (rps3) als potentielle ZmPPR6-Bindungsstelle identifiziert. Die Assoziation zwischen dem ZmPPR6 und dem rps3-Transkript konnte durch EMSA- und Northwestern-Experimente in vitro belegt werden.
Immunologische Untersuchungen mit einem RPS3-spezifischen Antikörper haben gezeigt, dass die Menge des RPS3-Proteins in der Mutante drastisch reduziert ist. Basierend auf dieser Beobachtung und darauf, dass eine Beteiligung an RNA-Stabilität, -Spleißing und -Editing durch experimentelle Analysen ausgeschlossen werden konnte, wurde dem ZmPPR6-Protein eine mögliche Translationsfunktion zugeschrieben.
Kurzfassung auf Englisch: Pentatricopeptide repeat (PPR) proteins are members of one of the largest nucleus-encoded gene families. Here we describe a new mitochondria-targeting PPR protein required for kernel development. The corresponding gene, which we named ppr6, was isolated from a Mutator-induced collection of maize kernel mutants by a novel cDNA-based forward genetic approach. Identification of a second mutant allele and a cosegregation analysis confirmed correlation with the mutant phenotype. Histological investigations revealed that the seed mutation coincides with abnormities in the transfer cell layer, retardation of embryo development and a considerable reduction of starch level. Mutating the putative orthologous gene in Arabidopsis led to a phenotype similar to that of ppr6 which we were able to complement by the heterologous expression of the Zm ppr6 gene. GFP/dsRed fusion studies confirmed the predicted subcellular localization of PPR6 within mitochondria. To identify the target mtRNA associated in vivo with PPR6 protein a co-immunoprecipitation coupled with RT-PCR was carried out. This assay revealed a potential association between PPR6 and the ribosomal protein S3 (rps3) mRNA. In vitro binding studies by electrophoretic mobility shift assay and Northwestern analysis confirmed binding of PPR6 to rps3 RNA. Investigation showed that the level of the corresponding translational product was strongly reduced in the mutant. Our results suggest that PPR6 might be involved in regulating translational initiation of rps3 mRNA.

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