Switching Human Cell Fate: Reprogramming via pluripotency to adipogenesis

Abstract

In a series of groundbreaking papers, (Maherali et al., 2007b; Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig et al., 2007) showed that ectopic expression of the transcription factors Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 in murine somatic cells reprogrammed the cells to a pluripotent stage. Because these iPS cells were molecularly and functionally equivalent to embryonic stem cells, their potential as a tool for studying disease phenotypes was immediately apparent. It was also clear at the time that if the technology could be translated into humans, human iPS cells would be a source of patient-matched cells for transplantation and the study of complex human disease. Furthermore, unlike human embryonic stem cells, iPS cells could be derived without destruction of embryos. Thus, at the time I started working on iPS cells, several key outstanding issues remained. Would it be possible to derive iPS cells from humans? Are all cell types equally amenable to reprogramming? Could iPS cells be derived without integrating the overexpression vectors, thus avoiding the risk of integrational mutagenesis? How efficiently could iPS cells be differentiated into varying somatic cell types, and what protocols would be needed? The three studies presented in this thesis address these questions. They thus represent important contributions to the field of stem cell biology. Our first study was the first to show that multiple sources of human somatic cells could be reprogrammed into iPS cells using the same set of transcription factors. We identified keratinocytes as a new and more suitable source of starting cells. Keratinocytes can be reprogrammed more quickly and with higher efficiency than fibroblast lines. They are also easily obtained by hair-pulls and skin punch biopsies. In the same study we were the first to develop an inducible system of iPS reprogramming. Such a system allows for the study of reprogramming events in a more homogenous cell population, where all cells expressing the transgenes, and we observed a 100-fold increase in reprogramming efficiency. Our second study advanced the field of stem cell biology by using virus-free reprogramming based on serial transfection of modified RNAs. The protocol represents a significant contribution to the field of regenerative medicine because of its relative simplicity and effectiveness. Thus, it has the potential to become the standard for human iPS derivation. Moreover, the efficiency of our iPS derivation was higher than in any prior used method. This is particularly important as other non-integrating derivation methods are very inefficient and thus impractical. Our third study moved from the derivation of iPS cells to their experimental applications. We differentiated, or programmed, adipocytes from pluripotent cells through the inducible overexpression of PPARγ. This differentiation is both robust and highly efficient. Moreover, our derived adipocytes do not require prolonged transgene expression. Prior to our work, few studies showed that adipocytes could be derived from pluripotent cells and these studies provided very limited characterization of the differentiated cells. We characterized the cells extensively, showing expression of nearly all mature adipocyte markers. We also showed that these cells are functional in that they release adiponectin and glycerol in response to beta-adrenergic stimuli. The rational manipulation of adipose physiology and the use of in vitro derived adipocytes for drug screening is a promising avenue towards understanding obesity and, ultimately, developing therapies for associated pathological conditions such as cardiovascular disease and stroke. In conclusion, this thesis provides novel biological insights and experimental procedures that facilitate reprogramming of human somatic cells to pluripotency as well as the differentiation or programming of pluripotent cells to a mature adipocyte state. This may ultimately help us to gain insights into disease mechanisms and makes a step towards the final goal of regenerative medicine.

Eine Serie von innovativen Publikationen (Maherali et al., 2007b; Takahashi et al., 2007; Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig et al., 2007) hat gezeigt, dass ektopische Expression der Transkriptionsfaktoren Oct4, Sox2, c-MYC und Klf4 somatische Zellen von Mäusen in einen pluripotenten Zustand reprogrammieren können. Diese induzierten pluripotenten Stammzellen teilen alle wichtigen Eigenschaften mit embryonalen Stammzellen und sind funktionell und molekular als gleichwertig zu betrachten. Es war sofort klar, dass diese Technologie ein grosses Potential für die medizinische Forschung hat, sollte es gelingen die Ergebnisse im humanen System zu etablieren. Im Gegensatz zur Herstellung von humanen embryonalen Stammzellen, müssten bei der Gewinnung von patientenspezifischen humanen iPS-Zellen keine Embryonen zerstört werden. Humane iPS Zellen könnten als Quelle für regenerative Therapien in Frage kommen und möglicherweise das Problem der Immunabstossung umgehen. Kurzfristig jedoch realistischer ist es, das Potential der Zellen für die in vitro Untersuchung der Pathogenese von diversen Krankheiten einzusetzen. Am Beginn meiner Doktorarbeit gab es viele offene Fragen. Wäre es möglich iPS Zellen von humanen Zellen zu generieren? Können alle somatischen Zellen durch Reprogrammierung in einen pluripotenten Zustand überführt werden? Da einige der eingesetzten Reprogrammierungs-Vektoren bekannte Onkogene sind und zusätlich Mutationen durch genomische Integration verursacht werden, gab es die wichtige Frage, ob iPS Zellen integrationsfrei generiert werden können? Die wichtigste Eigenschaft von pluripotenten Stammzellen ist das inhärente Potential jede Zelle des Körpers zu bilden jedoch sind bestehende Protokolle meist technisch anspruchsvoll und ineffizient. Ist es möglich pluripotente Zellen einheitlich zu erwünschten Zellen zu differenzieren (programmieren), indem man die notwendigen Transkriptionsfaktoren überexprimiert und damit Analyse und Nutzung der Zellen optimiert werden? Die drei Manuskripte, die in dieser Dissertation vorgestellt werden, versuchen einige dieser Fragen beantworten. In der ersten Studie konnten wir zeigen, dass verschiedene humane somatische Zellen zu pluripotenten Zellen reprogrammiert werden können. Wir haben als erste Gruppe demonstriert, dass Keratinozyten als geeignete Startzellpopulation dienen können, da sie schneller und effizienter als Fibroblasten zu reprogrammieren sind. Die Gewinnung von Keratinozyten ist minimal invasiv, aus Haarwurzeln oder Haut-Biopsien möglich. Weiterhin haben wir ein induzierbares sekundäres System fuer die Reprogrammierung von somatischen Zellen entwickelt. Durch die Reaktivierung der Transgene können differenzierte iPS Zellen erneut zu nun sekundären iPS Zellen reprogrammiert werden. Das erlaubt die Analyse von Reprogrammierungs-Mechanismen in einer homogenen Zellpopulation. In der zweiten Studie haben wir ein integrationsfreies Reprogrammierungs-Protokoll entwickelt, welches eine wiederholte Transfektion von modifizierten RNA’s beinhaltet. Das Protokoll ist ein signifikanter Beitrag für das Feld der regenerativen Medizin weil es einfach aber hocheffektiv ist. Dies ist insbesondere von Bedeutung, da andere nicht-integrative Methoden technisch kompliziert sehr ineffizient oder nicht vollständig integrationsfrei sind. In der dritten Studie nutzten wir die generierten iPS Zellen und differenzierten diese durch die vorübergehende Überexpression des Transkriptionsfaktors PPARγ zu Adipocyten. Vorherige Studien haben gezeigt, dass eine geringe Fraktion der pluripotenten Zellen prinzipiel zu Adipocyten differenziert werden können. Die Charakterisierung dieser Zellen war jedoch minimal. Mit unserem Protokoll sind wir in der Lage 80-85% der Zellen zu Adipocyten zu differenzieren. Unsere ausführliche Charakterisierung zeigten funktionell Lipolyse und Sekretion von Adiponektin sowie molekular die Markerexpression von ausgereiften Adipocyten. Zusammenfassend lieferte diese Doktorarbeit neuartige biologische Erkenntnisse über die Faktoren-vermittelte Reprogrammierung von humanen somatischen Zellen zu iPS und deren Transkriptionsfaktor vermittelte Differenzierung zu Adipozyten. Die Studie von patientenspezifischen Adipozyten mag zu Verständniss von pathologischen Mechanismen und letztendlich zu neuen Therapien der assozierten Folgeerkrankungen wie Typ-2-Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Schlaganfall führen.