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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-50560
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5056/


Funktionelle Analyse der Rev Transaktivierung des Humanen Immundefizienzvirus Typ 1

Hoffmann, Dirk

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SWD-Schlagwörter: HIV , RNS-Bindungsproteine , Messenger-RNS , Retroviren
Freie Schlagwörter (Deutsch): RNS Transport
Freie Schlagwörter (Englisch): HIV , RNA transport , RNA binding proteins
Basisklassifikation: 42.32 , 42.13 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.01.2011
Erstellungsjahr: 2010
Publikationsdatum: 18.07.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Das HIV-1 Transaktivatorprotein Rev ist ein essentieller Regulator der Virusreplikation. Rev vermittelt den Kernexport, die Stabilität und die Translation der viralen ungespleißten und einfach-gespleißten mRNAs, welche für die viralen Strukturproteine und Enzyme (Gag, Pol, Env) kodieren. Rev interagiert mit diesen viralen Transkripten über die direkte Bindung an ein hochstrukturiertes RNA Motiv innerhalb der env-Region, dem RRE (Rev Response Element). Die Bindung eines Rev Monomers führt zur Bildung von homomulitmeren Rev Komplexen entlang der RRE-RNA. Danach interagiert Rev über sein Kernexportsignal (NES), welches sich in der carboxyterminalen Aktivierungsdomäne von Rev befindet, mit dem zellulären Kernexportrezeptor CRM1. Dieser transportiert die Rev-enthaltenden RNP Komplexe durch die Kernporenkomplexe (NPC) vom Zellkern in das Zytoplasma der Wirtszelle. Neben CRM1 wurden bisher noch mehrere weitere Wirtszellfaktoren beschrieben, die an diesem Prozess direkt oder indirekt beteiligt sind.
Das Ziel dieser Arbeit war, die Rolle der Multimerisierung bei der Rev Transaktivierung im Detail zu untersuchen und putative Rev Kofaktoren funktionell zu charakterisieren.
Im Rahmen dieser Studie konnte anhand einer multimerisierungsdefizienten Rev Mutante gezeigt werden, dass die Multimerisierung von Rev für den nukleozytoplasmatischen Transport von gag und env mRNA notwendig ist. Für die Interaktion von Rev mit CRM1 und sein Pendeln zwischen Zellkern und Zytoplasma (Shuttling), in Abwesenheit von RRE-RNA, muss das virale Protein jedoch keine homomultimeren Komplexe bilden. Rev trägt unabhängig von seinem multimeren Status zur Stabilisierung der viralen ungespleißten mRNA bei. Die Bildung von Rev Dimeren über heterologe Dimerisierungsmotive ist ausreichend, um die Rev Transaktivierung einer biologisch inaktiven multimerisierungsdefizienten Rev Mutante zu einem großen Teil wiederherzustellen. Es wurde zudem gezeigt, dass in einem funktionellen RNP Komplex zwei Rev Aktivierungsdomänen benötigt werden. Vermutlich vermittelt hierbei eine zweite Rev Aktivierungsdomäne entweder die Interaktion mit einem weiteren CRM1 Molekül oder die Rekrutierung zusätzlicher, bisher noch nicht identifizierter Wirtszellfaktoren.
Im Rahmen der Rev Transaktivierung wurden die beiden zellulären Proteine der Signal
Transduction and Activation of RNA (STAR) Familie Sam68 und SLM2 genauer
charakterisiert. Hierbei stellte sich heraus, dass Sam68 signifikant die Expression von Gag Strukturproteinen erhöht, wodurch in murinen Zellen die bekannte natürliche Blockade bei der HIV-1 Assemblierung umgangen werden kann. Sam68 stellt jedoch keinen Speziesspezifischen Restriktionsfaktor in Mauszellen dar, da die Sam68 Funktion einen allgemeinen 6 Zusammenfassung
Effekt auf virale ungespleißte mRNA ausübt, unbeeinflusst von der Tatsache, ob die viralen Transkripte Rev-abhängig oder Rev-unabhängig ins Zytoplasma transportiert wurden.
In permissiven humanen Epithelzellen und Lymphozyten beeinträchtigte die Hemmung von Sam68 durch RNA Interferenz (RNAi) nicht die HIV-1 Replikation. Die Funktion von Sam68 wird in diesen Zellen vermutlich durch SLM2 ersetzt. Hierbei zeigte sich SLM2 in RNAi Studien als notwendiger Faktor für die virale Replikation. Die Hemmung von SLM2 verhinderte sowohl einen effizienten Kernexport von ungespleißter mRNA, als auch deren Spleißen im Zellkern. Dies deutet auf eine frühe Funktion von SLM2 bei der HIV-1 Genexpression hin, die möglicherweise zur 3’-End Prozessierung der viralen mRNA beiträgt. Zusammengefasst kann festgestellt werden, dass die beiden Proteine Sam68 und SLM2 eine distinkte Rolle im Replikationszyklus von HIV-1 spielen, hierbei aber nicht direkt die Rev Transaktivierung beeinflussen. Die einzelnen STAR Proteine bilden aller Voraussicht nach einen variablen heteromultimeren Komplex, in dem Sam68 und SLM2 redundante Funktionen bei der HIV-1 Genexpression ausüben.
Die gewonnenen Erkenntnisse ermöglichen ein verbessertes Verständnis der Funktion von Rev und den zellulären Faktoren Sam68 und SLM2 im Zuge der HI-Virusreplikation. Dies trägt zur weiteren Aufklärung des genauen Mechanismus der Rev Transaktivierung bei.
Kurzfassung auf Englisch: The HIV-1 trans-activator protein Rev is an essential regulator of viral replication. Rev
promotes the nuclear export, stability and translation of unspliced and partially spliced HIV-1 mRNA encoding the viral structural proteins and enzymes (Gag, Pol, Env). Rev interacts with these viral mRNAs by directly binding to the RRE (Rev Response Element), a highly structured RNA stem loop region within the env sequence. After binding as a monomer Rev forms a homomultimeric complex on the RRE-RNA structure. Subsequently, Rev interacts with the nuclear export receptor CRM1 via its nuclear export signal (NES), which is part of the carboxy-terminal activation domain of the protein. Thereupon, CRM1 mediates the nucleocytoplasmic transport of Rev-containing RNP complexes through nuclear pore complexes (NPC) of the host cell. Besides CRM1, various additional cellular factors have been described, which may directly or indirectly participate in Rev trans-activation.
The purpose of these studies was to analyze the role of Rev’s multimerization for Revmediated trans-activation in detail and, furthermore, to functionally characterize selected putative Rev cofactors. These studies revealed that the formation of a Rev homomultimer is essential for the nucleocytoplasmic transport of viral gag and env mRNA. However, multimerization is not required for the interaction of Rev with CRM1 and therefore for Rev shuttling in the abscence of the RRE-RNA binding. Rev promotes the stability of viral gag mRNA independent of its multimeric status. Formation of a Rev dimer via heterologous dimerization motifs is apparently sufficient to significantly reconstitute Rev trans-activation in an otherwise biological inactive multimerization-deficient Rev mutant. Furthermore, it was demonstrated that at least two Rev activation domains are required to form a functional (i.e. nuclear exportcompetent) RNP complex. The presence of a second Rev activation domain therefore mediates either the interaction with an additional CRM1 molecule or the recruitment of one or more additional, so far unknown, cellular cofactors. Two members of the signal transduction and activation of RNA (STAR) protein family Sam68 and SLM2 were further characterized with respect to their function in Rev trans-activation.
Sam68 significantly enhanced Gag expression and was able to bypass the established HIV-1 assembly block in murine cells. However, Sam68 did not constitute a species-specific restriction factor in murine cells, since Sam68 enhanced expression of unspliced viral mRNA in general, irrespective of the fact whether or not these transcripts were subject to Revregulation.
8 Abstract Interestingly, the silencing of Sam68 by RNA interference (RNAi) does not inhibit HIV-1 replication in human permissive epithelial or lymphoid blood cells. In these cells Sam68 activity was apparently compensated by increased SLM2 expression. Moreover, it was shown by RNAi studies that SLM2 constitutes a crucial factor for HIV-1 replication. The RNA silencing of SLM2 inhibited both, efficient nuclear export of viral unspliced RNA and their splicing. Therefore, SLM2 seems to play a role in an early step of HIV-1 gene expression, conceivably by promoting 3’-end processing of viral transcripts. In sum, both proteins Sam68 and SLM2 play a distinct role in the replication cycle of HIV-1, but do not directly contribute to Rev trans-activation. These STAR proteins presumably form a variable heteromultimeric complex, in which Sam68 and SLM2 play a redundant role during viral gene expression. These studies improved the understanding of the mechanisms involved in Rev-mediated trans-activation and further elucidated the role of the cellular factors Sam68 and SLM2 in HIV-1 replication.

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