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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54761
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5476/


p53-vermittelte Mechanismen der Differenzierung und epigenetischen Regulation in Karzinomstammzellen

p53-mediated mechanism of differentiation and epigenetic regulation of carcinoma stem cells

Kluth, Mark-Andreas

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Differenzierung , Protein p53 , Epigenetik , Embryonalentwicklung
Freie Schlagwörter (Deutsch): long interspersed nuclear elements , Stammzellen , Aldefluor , F9-Zellen
Freie Schlagwörter (Englisch): long interspersed nuclear elements , stem cells , p53 , epigenetic , differentiation , f9 cells
Basisklassifikation: 42.32 , 42.20 , 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 10.01.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Embryonale Karzinomzellen zeigen vergleichbare Eigenschaften zu den Zellen der inneren Zellmasse des frühen Embryos und zeichnen sich in vitro durch ihre definierte und gut charakterisierte Differenzierbarkeit aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die F9-Zellkultur als gut-beschriebenes Differenzierungsmodell verwendet, um die Funktion des Tumorsuppressors p53 im komplexen Prozess der Differenzierung zu untersuchen. Dabei ließ sich durch gezielte Markierung und Trennung der Zellen anhand ihrer Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität (AldefluorTM) eine hierarchische Organisation von Zellen mit Stammzelleigenschaften innerhalb der Gesamtkultur nachweisen. Die Analyse des Stammzellkompartiments zeigte die Anreicherung von p53 innerhalb dieser stark-proliferierenden Zellen und Depletions- sowie Überexpressionsanalysen bestätigten einen direkten Zusammenhang zwischen dem Erhalt der Stammzelleigenschaften und der Expression des p53-Proteins. Nach der Retinsäure-induzierten Differenzierung der F9-Zellen kommt es zur Abnahme der p53-Proteinexpression sowie morphologischen und expressionellen Veränderungen. Die stabile Reduktion des p53-Proteins durch p53-spezifische shRNA führte zu einer verminderten Differenzierbarkeit der Zellen, was die Funktion des Proteins im Prozess der embryonalen Differenzierung unterstreicht. In embryonalen Stammzellen und embryonalen Karzinomzellen findet sich eine starke Expression von LINE1-Elementen (Long Interspersed Nucleotide Element, L1), die einen Großteil des Mausgenoms ausmachen und für die eine Beteiligung an der Regulation der
Genexpression vorgeschlagen wird. Mithilfe einer bioinformatischen Analyse ließ sich die Anzahl von „full length“ LINE1-Elementen (FL-L1) innerhalb des Mausgenoms bestimmen. Durch Mikroarray-basierte Genexpressionsstudien von F9-Zellen wurden die Gene identifiziert, deren Transkription im Verlauf der Differenzierung signifikant zunimmt. Einige dieser Gene sind mit den FL-L1-Elementen, welche entweder in der
intergenen oder intronischen DNA liegen, assoziiert. Aufgrund der in humanen Zellen beschriebenen Aktivierung der L1-Promotoraktivität durch p53 wurde der mögliche Zusammenhang auch in F9-Zellen untersucht. Dazu wurde die Bidirektionalität des Maus-L1-Promotors und dessen Abhängigkeit von p53 getestet. Während das p53-Protein die L1 sense- und antisense Promotoraktivität der Gesamtheit aller L1-Promotoraktivität Gen-assoziierter FL-L1-Elemente von p53 stimuliert. Diese L1-initiierte antisense-Transkription vermittelt in F9-Zellen das offene Chromatin der während der Differenzierung aktivierten Gene. Im Falle der intronischen FL-L1-Elemente, z.B. im Egflam-Gen, steht diese antisense-Transkription in Konkurrenz zu
der basalen Transkription des entsprechenden Gens, so dass sich von einer
transkriptionellen Interferenz sprechen lässt. Das L1-initiierte antisense Transkript aus intergenen FL-L1-Elementen vermittelt die p53-abhängige transkriptionelle Kompetenz der Genumgebung, wie z.B. im Falle des Dab2-Gens. Durch die p53-regulierte antisense Transkription aus dem Maus-L1-Promotor, die eine wichtige Komponente der epigenetischen Regulation der differenzierungsspezifischen Gentranskription darstellt, liefert diese Arbeit erstmalig Hinweise auf eine neuartige Funktion von p53 in nicht-gestressten Zellen. Die schädigenden Seiteneffekte der sense Transkription retrotranspositionskompetenter FL-L1-Sequenzen werden durch die p53-abhängige Expression der Apobec-Proteinfamilie supprimiert. Die
Ergebnisse dieser Arbeit zeigen den Zusammenhang zwischen L1-Retrotransposons und dem Wirtsgenom und können zum besseren Verständnis der transkriptionellen Regulation von differenzierungsspezifischen Genen in embryonalen Stammzellen
beitragen.
Kurzfassung auf Englisch: Embryonic carcinoma cells exhibit properties comparable to those of inner cell mass cells of the early embryo and they are characterized by a well-described in vitro differentiation. During this work the F9-cell culture, a well-characterized cell differentiation model was used to study the function of the tumor suppressor p53 during retinoic acid induced differentiation. FACS-separation of cells based on their Aldehyde dehydrogenase activity (AldefluorTM) enables the identification of hierarchically organized cells within the F9 cell culture. Furthermore, characterization of the stem cell compartment revealed an enrichment of p53 protein within the fast proliferating cells and p53 depletion or ectopic expression of p53 established a link between p53 expression and stemness of F9 cells. The treatment of cells with retinoic acid induces cell differentiation resulting in several morphological and phenotypic changes. However, stable depletion of p53 mediated by p53-specific shRNA reduced the potential of cells to differentiate. These results demonstrate the function of p53 during embryonic differentiation. The expression of LINE1-elements (Long Interspersed Nucleotide Elements, L1) is highly increased in stem and
carcinoma cells. L1 sequences build up a major part of the mouse genome and they are presumed to participate in regulating cell differentiation. Bioinformatic analysis enables the mapping of full length LINE1-elements (FL-L1) within the mouse genome. Microarray analysis of F9-cells revealed the enrichment of FL-L1 elements localized either to intronic or intergenic regions in respect to the transcriptional start site of genes which are regulated during cell differentiation. For humans, a p53-dependent stimulation of L1 promoter activity has already been described. Therefore,
the p53-dependent regulation of L1 promoter activity was determined in mouse F9 cells. The data revealed that while p53 is not involved in regulating overall L1 sense and antisense promoter activity, it regulates both activities of individual FL-L1 elements localized whithin differentially regulated genes. This antisense L1-initiated transcription contributes the maintenance of a transcriptionally competent chromatin state of genes up-regulated during differentiation. In the case of intronic FL-L1 elements, for example in the Egflam gene, the antisense transcript competes (transcriptional interference) with the transcript generated by basal gene transcription. The antisense L1-initiated transcription of intergenic FL-L1 elements mediates the p53-dependent transcriptional competence of neighboring genes, as in
the case of the Dab2 gene. This work provide evidence for a novel function of p53 in non-stressed cells by demonstrating that p53-dependent anti-sense transcription from mouse L1 promoters is an important component of the epigenetic regulation of differentiation-specific gene transcription. The deleterious side effects of sense transcription of retrotransposition-competent FL-L1 sequences are suppressed by p53-dependent expression of the Apobec protein family. This is the first demonstration of a symbiotic relationship between LINE1 retrotransposons and the host genome, which will have profound impact on understanding transcriptional regulation of differentiation-specific genes in embryonic stem cells.

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