Analyse der DNA-Integrität von ejakulierten und testikulären Spermatozoen

Abstract

Infertilität betrifft mit einer Prävalenz von 15% viele Paare in Deutschland. Zur Verbesserung der Behandlungsmöglichkeiten eines unerfüllten Kinderwunsches ist eine effiziente Kausalitätsforschung wichtig. Die nach WHO-Kriterien durchgeführten Ejakulatuntersuchungen korrelieren nach aktueller Studienlage nicht ausreichend mit Fertilisierungsfähigkeit, Implantations- und Geburtenrate. In vielen Studien wurde bereits ermittelt, dass ein hoher DFI in Spermien mit männlicher Infertilität korreliert. Es haben sich bisher drei Methoden zur Untersuchung der DNA in Spermienausstrichen als perspektivisch klinisch relevant erwiesen: Die neutrale Comet-Analyse, die SCSA®- und die TUNEL-Methode. In dieser Arbeit wurde die TUNEL-Methode angewendet, da diese aufgrund der direkten Fragmentierungsmessung als besonders aussagekräftig anzusehen ist. Es war nicht möglich, die DNA-Integritätsanalyse des FACS™ mit Hilfe des Bioanalyzer, einem Gerät zur Detektion und Quantifizierung von DNA, RNA, Proteinen und Zellen mittels Fluoreszenz, zu etablieren. Zurzeit wird noch kontrovers diskutiert, ob es sich bei DNA-Fragmentierung um ein intra- oder posttestikuläres Phänomen handelt. Der Vergleich der DNA-Integrität von ejakulierten Spermien und Spermien in Hodenbiopsien lässt vermuten, dass die DNA-Strangbrüche posttestikulär entstehen. Die Fragmentierung ereignet sich entweder während der Passage durch den Nebenhoden oder post ejaculationem. In den Hodenbiopsien, welche mittels mDF fixiert worden waren, erschien die DNA nahezu intakt. Im Gegensatz zum Ejakulat war kaum DNA-Fragmentierung nachweisbar. Die nachgewiesene Fluoreszenz konzentrierte sich in den Biopsien vor allem auf Spermatozyten, sodass von transienten Einzelstrangbrüchen während der Meiose ausgegangen werden kann. Aufgrund der Tatsache, dass intratestikulär keine nennenswerte Fragmentierung nachweisbar ist, wäre es denkbar, bei hohen ejakulatorischen Fragmentierungsraten testikuläre Spermien für ICSI zu verwenden, um so höhere Schwangerschaftsraten zu erzielen. Derzeit bietet das Methodenspektrum der DNA-Integritätsanalyse noch keine gesicherte Grundlage für Routinetestungen. Insgesamt eröffnet die Methodik aber eine Perspektive für eine verbesserte reproduktionsmedizinische Diagnostik und Behandlung ungewollt kinderloser Paare.

With a prevalence of 15%, infertility is a major burden for many couples in Germany. To improve the treatment of infertility research into its cause is important. A review of current clinical trials indicates that fertility tests according to WHO criteria are not sufficiently correlating to fertility rate, implantation rate and birth rate. Based on many studies it has been found, that a high DNA fragmentation index (DFI) in sperm correlates with male infertility. Three methods of DNA integrity testing were found to be promising: The neutral comet analysis, SCSA® and TUNEL. In this study TUNEL was applied, because it was found to be particularly significant due to the direct measurement of DNA fragmentation. It was not possible to establish the DNA integrity analysis of FACS™ in an inexpensive and timesaving way by using the Bioanalyzer, which is an instrument to detect and quantify DNA, RNA, proteins and cells via fluorescence. At present there is still a controversial discussion whether DNA fragmentation is an intra- or post-testicular event. Based on this study’s results of fluorescence microscopic analysis on sperm smears and testicular biopsies it is assumed, that DNA strand breaks arise post-testicularly. The DNA fragmentation occurred either during the passage through the epididymis or post ejaculation. The DNA in these testicular biopsies, which were fixed with mDF maintaining an excellent morphology, appeared almost intact. In contrast to ejaculated sperm, virtually no DNA fragmentation was detectable. The fluorescence detected in testicular biopsies was encountered mainly in spermatocytes, possibly induced by transient single-strand breaks during meiosis. Due to the fact that no significant fragmentation is detectable intratesticularly, it might be feasible for men with a high DFI in ejaculated sperm to use testicular sperm for ICSI in order to achieve a higher birth rate. Currently, DNA integrity analysis offers no indication for routine testing of sperm, but may have substantial merit for medical diagnosis and treatment of unintentionally childless couples.