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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-54906
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5490/


Synthese von C8-Arylamin-modifizierten 2´-Desoxyguanosin-Phosphoramiditen und deren Einbau in Oligonucleotide

Synthesis of C8-(N-Acetyl)-arylamine-modified 2´-Deoxyguanosine Phosphoramidites and their site specifically Incorporation into Oligonucleotides

Krüger, Sarah

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SWD-Schlagwörter: Antisense-Oligonucleotide , Oligonucleotide , Arylamine , DNS
Basisklassifikation: 58.00
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meier, Chris (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 02.02.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Poly- und monocyclische aromatische Amine gehören zur Klasse chemischer Carcinogene, die nach metabolischer Aktivierung kovalent gebundene Addukte mit der DNA ausbilden. Diese nach Metabolisierung unter Bildung von hochreaktiven Nitreniumionen umgewandelten Verbindungen reagieren mit den Nucleobasen der DNA und führen in unterschiedlichem Maße zur Bildung von Mutationen. Das vorwiegend gebildete DNA-Addukt ist das in der C8-Position des 2´-Desoxyguanosin. Ziel der vorliegenden Arbeit war es verschiedene C8-modifizierte 2´-dG-Addukte sequenzspezifisch in verschiedene Oligonucleotide einzubauen und so das mutagene Potential, die Struktur und die Reparatur dieser Addukte zu untersuchen.
Zur Ermittlung der Auswirkungen der C8-NH- und C8-(N-Acetyl)-arylamin-Addukte, mussten diese zuerst synthetisiert und dann in die entsprechenden Phosphoramidite umgewandelt werden. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Syntheseweg der acetylierten 2´-dG Phosphoramidite. Ein Ziel war es, eine Optimierung der Synthese der C8-(N-Acetyl)-Addukte unter Verwendung einer basenlabilen Schutzgruppe für die exocyclische Aminofunktion von 2´-dG zu erreichen, um die Zeit der Entschützung nach der Oligonucleotidsynthese zu verkürzen. Der entscheidende Schritt dieser Synthese war die Einführung der entsprechenden Hydroxamsäure in die C8-Position des O6-Benzotriazol aktivierten 2´-Desoxyguanosins (siehe Seite 54). Nach Abspaltung der 3´,5´-TBDMS-Gruppen wurde die Formamidingruppe eingeführt, um die exocyclische Aminofunktion zu blockieren. Anschließend wurden durch Dimethoxytritylierung und Phosphitylierung der Verbindungen 110-115 die entsprechenden Oligonucleotid-Bausteine 128-133 synthetisiert. Die vollständige Synthese dieser Addukte verlief mit nur sieben Stufen in einer Gesamtausbeute von 17-42%.
Der zweite Teil dieser Arbeit war die Synthese der C8-NH-Arylamin-2´-dG Phosphoramidite. Der entscheidende Schritt dieser Syntheseroute war die Pd-katalysierte Buchwald-Hartwig-Kreuzkupplung (siehe Seite 79). Nach der vollständigen Entschützung dieser Addukte 151-153 wurde die Formamidingruppe eingeführt, um die exocyclische Aminofunktion zu blockieren. Anschließend wurden durch Dimethoxytritylierung und Phosphitylierung der Verbindungen 154-156 die entsprechenden Phosphoramidite 160-162 synthetisiert (siehe Seite 82).
Die C8-NH- und C8-(N-Acetyl)-arylamin modifizierten Phosphoramidite 128-133 und 160-162 wurden in drei verschiedene Oligonucleotid-Sequenzen eingebaut.
Zum Einen wurde die NarI-Sequenz mit einer Modifikation in Position 4 oder 7 (5 ´-d (CTC GGC GCC ATC)-3´) verwendet, und zum Anderen die selbstkomplementäre EcoRI-Sequenz mit einer Erkennungssequenz für das Enzym EcoRI (5´-d (GTA GAA TTC TAC)-3´). Anhand dieser Sequenzen wurden die Auswirkungen auf die Hybridisierung und Struktur der resultierenden DNA-Helices untersucht. Als Ergebnis ist festzuhalten, dass anhand der Modifikationen kein Einfluss auf die Konformation beobachtet werden konnte. Die Studien bezüglich der Schmelztemperatur (Tm-Wert) zeigten dagegen alle eine Destabilisierung des modifizierten Duplex im Vergleich zum Referenzstrang, wobei die Auswirkungen der monocyclisch-modifizierten Oligonucleotide am deutlichsten waren. Zusätzlich wurden die Auswirkungen auf die Aktivität des Restriktionsenzyms EcoRI durch einen entsprechenden Abbau untersucht. Eine Modifikation direkt an der Schnittstelle führte zu einer vollständigen Inaktivierung des EcoRI-Enzyms. Dagegen konnte bei Einbau der Modifikation außerhalb der Erkennungssequenz ein Abbau beobachtet werden. Hierbei zeigte das monocyclisch-modifizierte Oligonucleotid den geringsten Einfluss auf das Enzym und das polycyclisch-modifizierte Oligonucleotid den größten Einfluss (siehe Seite 116). Zur Klärung der Auswirkungen von C8-NH- und C8-(N-Acetyl)-arylamin Modifikationen auf die Funktion verschiedener Polymerasen wurden modifizierte 20mer-Oligonucleotide mit der Sequenz 5´-d(ACA TGA GCA TCT ACG ACG CG)-3´ synthetisiert und als Template in Primer-Verlängerungs-Studien mit verschiedenen Polymerasen (Pfu, FIREPol®, Pol ß und Klenow exo-) eingesetzt (Kapitel 4.8, S. 116). Als Ergebnis dieser Untersuchungen lässt sich festhalten, dass die C8-DNA-Addukte starker Carcinogene bei diesen Versuchen eine geringere Rate an Fehleinbauten besitzen als die monocyclischen DNA-Schäden. So findet hier für die monocyclisch-modifizierten Oligonucleotide neben dem kanonischen Einbau eines dCTP´s mit derselben Häufigkeit auch der nicht-kanonische Einbau eines dTTP´s und dATP´s statt. Somit scheinen auch in diesen Fällen die monocyclischen Modifikationen einen höheren Einfluss auf die Enzyme zu haben.
Um Informationen über die Struktur der Oligonucleotide zu erhalten wurden erste Experimente zur Kristallisation der Oligonucleotide durchgeführt. Die erste erhaltene dreidimensionale Struktur des NarI-Duplexes ist einzigartig und zeigt die Form einer A-DNA. Weitere vielversprechende Ansätze zur Kristallisation der modifizierten 12mer- und 20mer-Oligonucleotide waren bei der Beendigung dieser Arbeit nicht abgeschlossen und werden an anderer Stelle publiziert.
Kurzfassung auf Englisch: Poly- and monocyclic aromatic amines belong to the class of chemical carcinogens that form covalently bonded adducts with DNA after metabolic activation. If these damages are not repaired, they can compromise the fidelity of DNA replication and cause mutations and possibly cancer. Until now no reason has been found for their different carcinogenic potential. The predominant site of reaction is the C8-position of 2´-deoxyguanosine 40. To properly study the biochemical effect and the structure of these DNA-adducts, it was the aim of this thesis, to develop strategies for the site-specific incorporation of these dG-carcinogen-adducts into oligonucleotides.
To determine the effects of the C8-NH- and C8-(N-acetyl)-arylamine-adducts, they were synthesized first and then transformed into phosphoramidites. The first part of this work deals with the synthetic pathway to the acetylated 2´-dG phosphoramidites. The primary goal was to achieve an optimization of the synthesis of C8-(N-acetyl)-adducts to shorten the period of time for the alkaline cleavage after oligonucleotide synthesis using a base labile protecting group for the exocyclic amino function of 2´-dG. The key step for this synthesis was the O6-benzotriazol activated 2´-dG coupling with the corresponding hydroxamic acid (see page 54). After the complete deprotection of the TBDMS-groups the formamidine group was introduced to block the exocyclic amino function. After that compounds 110-115 were converted into the corresponding oligonucleotide building blocks 128-133 by dimethoxytritylation and phosphitylation. The complete synthesis of these adducts took seven steps with an overall yield of 17-42%.
The second part of this work is concerned with the synthesis of the C8-NH-arylamine 2´-dG phosphoramidites. The key step was the Pd-catalyzed Buchwald-Hartwig cross-coupling (see page 78). After the complete deprotection of these adducts 151-153 the formamidine group was introduced to block the exocyclic amino function. Finally, compounds 154-156 were converted into the corresponding phosphoramidites 160-162 by dimethoxytritylation and phosphitylation (see page 82).
The C8-NH- and C8-(N-acetyl)-arylamine-modified phosphoramidites 128-133 and 160-162 were incorporated into three different oligonucleotide sequences.



First, the NarI-sequence with a modification in position 4 or 7 5´ d(CTC GGC GCC ATC)-3´, and a self complementary sequence with a recognition site for the EcoRI enzyme 5´-d(GTA GAA TTC TAC)-3´ were used to investigate the effects of the modification on hybridization and structure of the resulting DNA-helices. The result of these CD- and Tm-value studies was that no difference in structure was observed, but a higher decrease of the monocyclic modifications of the Tm-value.
Using the oligonucleotides of the EcoRI-sequence a restriction assay was performed. As a result, a total prevention of the 12mer-oligonucleotide was achieved by modifying the dG-nucleotide at the cleavage site. If the modification was outside the recognition sequence a higher influence for the C8-polycyclic-adducted oligonucleotides than for the monocyclic-modified one was observed, leading to a higher half-life (see page 115). To study the influence of C8-NH- and C8-(N-acetyl)-arylamine adducts on the effectiveness of DNA-polymerases, oligonucleotides of the following sequence were synthesized 5´ d(ACA TGA GCA TCT ACG ACG CG)-3´ and used as templates in primer-extension experiments. Four different polymerases were used, Pfu, FIREPol®, KF exo- and Pol ß (see page 116). The primer-extension experiments with the modified oligonucleotides revealed differences between the four polymerases and between the modifications. The most important result was that there was a much more significant misinsertion of nucleotides for the monocyclic, acetylated modification (dATP instead of dCTP) opposite the modified base. This effect was also observed for the strong carcinogen adducts, however, it was very small in comparison.
First experiments for the crystallization of the oligonucleotide were performed to gain information about the structure of modified oligonucleotides. The first obtained three dimensional structure of the NarI dodecamer DNA presented here is unique and showed an A-DNA conformation (see page 134). Promising experiments for the crystallization of the modified 12mer and 20mer sequences are currently underway in our laboratories and were not terminated when this thesis was finished.


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