Herstellung genetisch attenuierter Plasmodien zur Vakzinierung: Neue Ansätze zur Blockierung der Parasitenentwicklung in der späten Leberphase

Abstract

Für die Bekämpfung der Malaria existiert bisher noch kein kommerziell erhältlicher Impfstoff. Wissenschaftliche Studien zeigen jedoch, dass durch eine Immunisierung mit genetisch attenuierten Parasiten, deren Entwicklung in der späten Leberphase arretiert, ein steriler, stadien- und speziesübergreifender Schutz gegen eine Infektion mit voll-virulenten Plasmodiumparasiten erreicht werden kann. Die Herstellung sicherer genetisch attenuierter Parasiten erfordert mindestens eine doppelte Attenuierung der Parasiten. Bisher wurde dies über die Entfernung von Genen, die für die Leberphasenentwicklung essentiell sind, erreicht. Die Auswahl hierfür in Frage kommender Gene ist, bedingt durch die bisher relativ wenig erforschte Leberphase von Plasmodium, jedoch begrenzt. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neuer Ansatz zur Herstellung doppelt genetisch attenuierter Parasiten verfolgt. Unter Verwendung einer stadienspezifischen Promotorregion erfolgte zunächst die Herstellung einer transgenen, einfach attenuierten Plasmodium berghei Parasitenlinie, die in der späten Leberphase das bakterielle porenformende Protein Perfringolysin O (PFO) als V5-Fusionsprotein exprimiert (PbPFOLS). Die PFO::V5-Expression führte bei späten Schizonten zur vorzeitigen Lyse der parasitophoren Vakuolenmembran sowie der Parasitenplasmamembran. Infolgedessen kam es zu einer schnellen Freisetzung von Proteinen aus dem Parasiten- ins Wirtszellzytosol und letztlich zum Absterben der Parasiten. Mittels Immunfluoreszenzanalysen konnte gezeigt werden, dass die Parasiten zu diesem Zeitpunkt bereits Proteine der späten Leberphase exprimierten, was exemplarisch anhand von SERA2-Proteinen untersucht wurde. Interessant und unerwartet war, dass es durch die vorzeitige Lyse der parasitophoren Vakuolenmembran nicht zum Absterben der Wirtszelle kam. Erste Immunisierungsexperimente mit PbPFOLS-Parasiten in Balb/c und C57BL/6 Mäusen konnten zeigen, dass die immunisierten Mäuse steril gegen eine Infektion mit voll-virulenten Sporozoiten geschützt waren. Jedoch kam es nach der Immunisierung vereinzelt zu einer Blutinfektion mit PbPFOLS-Parasiten. Um eine vollständige Attenuierung zu erreichen, wurden doppelt attenuierte Parasiten hergestellt. Hierzu wurde eine Parasitenlinie generiert, die die PFO::V5-Expression mit der Deletion des für die Leberphase essentiellen Pyruvatdehydrogenase-E1alpha-Gens (pdh-e1alpha) kombiniert (Pbpdhko-PFOLS). Der Phänotyp der einfachen pdh-e1alpha-Gendeletion in P berghei wurde zuvor in einer hierfür hergestellten Parasitenlinie untersucht. Diese Charakterisierung ergab, dass die P. berghei pdh-e1alpha knockout Parasiten, im Gegensatz zu bereits publizierten P. yoelii pdh-e1alpha knockout Parasiten, nicht vollständig in der Leberphase attenuiert waren. Bei Experimenten mit den doppelt attenuierten Pbpdhko-PFOLS-Parasiten wurde hingegen erfreulicherweise weder in vitro noch in vivo die Bildung von Merosomen bzw. eine Blutinfektion beobachtet. C57BL/6 Mäuse, die mit Pbpdhko-PFOLS-Parasiten immunisiert wurden, waren 30 Tage nach der letzten Immunisierung komplett gegen eine Infektion mit Wildtypsporozoiten geschützt. Es konnte somit eindrucksvoll demonstriert werden, dass sich durch die stadienspezifische Expression eines Toxins in Kombination mit der Deletion eines essentiellen Gens sichere genetisch attenuierte Parasiten herstellen lassen. Dieses im Nagetiermodell neu etablierte System könnte zukünftig für die Attenuierung humanpathogener Plasmodium-Spezies getestet werden und dabei helfen, neue Erkenntnisse für die Entwicklung einer effektiven Malariavakzine zu gewinnen.