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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-55109
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5510/


Charakterisierung der Wechselwirkung von V3-Peptiden aus dem HIV-1 GP120 mit dem humanen Corezeptor CCR5 mittels SPR und STDD-NMR

Characterization of the interaction of V3 peptides from the HIV-1 gp120 with the human coreceptor CCR5 by SPR and STDD NMR

Wallach, Katharina Barbara

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SWD-Schlagwörter: HIV GP120, CCR5-Rezeptor, Oberflächenplasmonenresonanz, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung, STDD NMR
Freie Schlagwörter (Englisch): HIV gp120 , CCR5 , STDD NMR , SPR , ligand-receptor interaction
Basisklassifikation: 35.63 , 35.62
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2012
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 01.02.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Die Interaktion zwischen dem V3-Loop des GP120 aus dem HIV-1 und dem humanen Corezeptor CCR5 stellt einen entscheidenden Schritt des viralen entries dar. Eine detaillierte Aufklärung der V3-CCR5-Wechselwirkung ist daher für die Entwicklung von HIV entry-Inhibitoren essenziell und war Ziel dieser Arbeit. Aufbauend auf vorangegangenen Studien war es hierbei von besonderem Interesse, Peptide und Glycopeptide aus unterschiedlichen Bereichen des V3 Loops darzustellen und auf ihre Bindungseigenschaften zum CCR5-Corezeptor hin zu untersuchen.
In einer linearen Synthesestrategie mittels mikrowellenunterstützter automatisierter Fest-phasen¬peptid¬synthese konnten sechs lineare Peptide und Glycopeptide erfolgreich in guten bis sehr guten Ausbeuten dargestellt werden. Versuche, eine Cyclisierung der Peptide entweder in Lösung oder an der festen Phase zu erreichen, verliefen nicht erfolgreich.
Eine anschließende CD-spektroskopische Untersuchung aller synthetisierten Peptide ergab einen vergleich¬baren Anteil der Struktur¬elemente α-Helix, β-Faltblatt, β-turn und random coil.
Detailliertere Einblicke in die Konformation konnten mittels NOESY-NMR-Experimenten erhalten werden. Über die beobachteten long range-Kontakte wurde gezeigt, dass zumindest ein nennenswerter Anteil der C terminalen Peptide v3ct15 und v3ct21 eine helicale Struktur einnimmt. Die linearen Peptide v3o und v3og, die die gesamte Sequenz des V3-Loops beinhalten, zeigten eine räumliche Annäherung der N- und der C-terminalen Flanke bedingt durch das 310GPGRAF315-turn-Motiv an der Spitze des V3-Loops. Die Peptide v3con und v3cong hingegen lagen in einer zufälligen Konformation vor.
Die Durchführung von SPR Experimenten ermöglichte eine Analyse der Affinität sowie der jeweiligen Assoziations¬¬kinetik der einzelnen Verbindungen. Alle untersuchten Peptide zeigten eine spezifische Interaktion mit CCR5-überexprimierenden HOS-Zellen. Hierbei wurden für die beiden Glycopeptide v3cong sowie v3og die höchsten kon-Werte bestimmt. Der signifikante Einfluss der Glycosylstruktur an Asn301 des V3-Loops auf die Assoziationsrate der V3 CCR5-Bindung konnte somit eindeutig nachgewiesen werden.
Hieran anschließende STD-NMR-Experimente mit CCR5-tragenden Liposomen gaben einen detaillierten Aufschluss über die Peptid-Rezeptor-Interaktion auf atomarer Ebene. Durch die Anwendung eines Doppeldifferenzfilters (STDD) konnten für die beiden Peptide v3ct15 und v3ct21 Bindungsepitope erstellt, sowie die thermodynamische Dissoziations¬konstante KD der Interaktion bestimmt werden. Die ermittelten KD-Werte lagen für beide Verbindungen jeweils im Bereich von 200 µM und gaben Hinweise auf einen Bindungs¬modus, der sich nicht mit berechenbaren Bindungsmodellen beschreiben lässt. Es konnten STD-Effekte beobachtet werden, die sich jeweils über die gesamten Peptidsequenzen erstreckten. Die Anwendbarkeit der STDD-NMR-Methode für die Untersuchung membran¬ständiger Moleküle, wie z. B. dem CCR5-Rezeptor, mit peptidischen Liganden konnte durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Die Analyse der linearen Peptide v3o und v3og ließ den Schluss zu, dass ihre Bindungskinetik für STD NMR-Experimente zu langsam ist. Eine Analyse der analogen cyclischen Verbindungen erscheint hierbei vielversprechend.
Ergänzend wurde ein in silico-Modell der V3-CCR5-Interaktion untersucht. Mithilfe dieses Modells konnten Abstände zwischen dem V3-Loop und der Rezeptoroberfläche berechnet und in theoretische STD-Prozentwerte umgerechnet werden. Diese wurden mit den experimentellen Daten der STD-NMR-Untersuchungen dieser und einer vorangegangenen Arbeit verglichen.[274] In Übereinstimmung mit diesen Daten konnte anhand des in silico-Modells gezeigt werden, dass überwiegend Aminosäuren aus dem N-terminalen stem-Bereich sowie die Glycosyl¬struktur des V3-Loops an der Rezeptorbindung beteiligt sind. Darüber hinaus konnten mit den Ergebnissen der STD-NMR-Analyse Wechselwirkungen der Aminosäuren Tyr316, Ala317 sowie Gln327 aus dem C-terminalen V3-Bereich mit dem Corezeptor nachgewiesen werden.
Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit konnte ein wichtiger Beitrag zur Aufklärung der Interaktion des V3-Loops aus dem GP120 mit dem humanen Corezeptor CCR5 geleistet werden. Das detaillierte Verständnis der V3-CCR5-Interaktion, welches im Rahmen dieser Arbeit erweitert werden konnte, bietet eine wertvolle Grundlage zur Entwicklung neuer entry-Inhibitoren, die einen maßgeblichen Beitrag zur Bekämpfung der Pandemie AIDS darstellen.
Kurzfassung auf Englisch: The interaction between the V3 loop of gp120 of HIV-1 and the human coreceptor CCR5 is a crucial step in the viral entry. Therefore, a detailed elucidation of the V3-CCR5 interaction is essential for the development of HIV entry inhibitors and was goal of this thesis. Based on previous studies, it was of particular interest to synthesize peptides and glycopeptides originating from different parts of the V3 loop and analyze their binding properties to the CCR5 coreceptor.
The synthetic glycopeptides v3cong and v3og contained a chitobiosyl unit as a minimal motive attached to asparagine 301. On that account, the required N-chitobiosyl asparagine building block (6) was successfully obtained via a five step synthetic route. Attempts to optimize the preparation of the two precusors chitobiose (3) and chitobiosylamine (4) did not lead to a significant increase of the overall yields.
By performing a linear synthetic strategy using microwave supported automated solid phase peptide synthesis, six peptides and glycopeptides were successfully synthesized in a range of good to very good yields. Attempts to obtain a cyclization of the peptides either in solution or on solid support were not successful.
A subsequent analysis by CD spectroscopy showed comparable contributions of the structural elements α helix, β-sheet, β-turn and random coil within all synthesized peptides.
A more detailed insight into the conformation of the peptidic compounds has been achieved by NOESY NMR experiments. A significant portion of the two C-terminal peptides v3ct15 and v3ct21 adapted a helical structure determined by long range NOE contacts. The two linear peptides v3o and v3og, which cover the entire sequence of the V3 loop, showed a spacial approximation of the N- and the C-terminal flanks due to the 310GPGRAF315 turn motif at the tip of the V3 loop. In contrast, the two peptides v3con and v3cong showed a random conformation.
In vitro studies of the interaction between the peptides and the membrane-incorporated CCR5 coreceptor were carried out by means of two methods: SPR and STD NMR. The performance of SPR experiments enabled the analysis of the affinity and the association kinetics of each individual compound. All of the analyzed peptides showed a specific interaction with CCR5-overexpressing HOS cells. In this context, the highest kon values were determined for the two glycopeptides v3cong and v3og. Thus, the significant influence of the glycosidic structure at Asn301 on the association rate of the V3 loop has unambiguously been proved.
Subsequent STD NMR experiments using CCR5-carrying liposomes gave detailed infor-mation of the peptide-receptor interaction at an atomic level. By the application of a double difference filter (STDD), the binding epitopes of the two peptides v3ct15 and v3ct21 were achieved and additionally, the values of the thermodynamic dissociation constant KD were determined. The KD values were determined to about 200 µM in case of both peptides indicating a binding mode which cannot be described by calculable binding models. Furthermore, STD effects ranging over the entire sequences have been observed. The applicability of the STDD NMR method for the examination of peptidic ligands with membrane-incorporated molecules, e. g. the CCR5 coreceptor, has been confirmed as a result of this study. The results of the analysis of the linear peptides v3o and v3og indicated a binding kinetics which is too slow to be observed by STD NMR experiments. The analysis of the corresponding cyclic compounds seems to be promising, however.
Additionally, an in silico model of the V3-CCR5 interaction was analyzed. Aided by this model, distances between the V3 loop and the surface of the receptor were calculated and converted to theoretical STD percentages. These data were compared to the experimental data of the STD NMR studies of this and a preceding study.[274] On the basis of this in silico model, it could be shown that predominantly amino acids from the N-terminal stem region as well as the glycosidic structure of the V3 loop are involved in the binding to the receptor. In good accordance with the results of the STD NMR analysis, the additional participation of the amino acids Tyr316, Ala317, and Gln327 from the C-terminal V3 region in the interaction with the coreceptor was shown.
The results of this study provide an important contribution to elucidate the interaction of the V3 loop of the gp120 with the human coreceptor CCR5. Results of previous studies could be supported and have been supplemented with new findings. The detailed comprehension of the V3-CCR5 interaction, which could be extended in context of this thesis, provides a valuable basis for the development of new entry inhibitors to account for the containment of the pandemia AIDS.

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