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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-55224
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5522/


Magnetically induced directed Cell Migration as a new Approach for Therapy of Glioblastoma

Magnetisch induzierte zielgerichtete Zell-Migration als ein neuer Ansatz zur Therapy von Glioblastoma multiforme

Mucha, Birte

pdf-Format:
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SWD-Schlagwörter: Magnetfeld, Lysosom, Glioblastom , Nanopartikel , Magnetit , Actin , Actin bindende Proteine , Actin-Filament , Zellmigration, Äußeres Magnetfeld
Freie Schlagwörter (Deutsch): N-WASP, Astrozyten, Gehirntumor
Freie Schlagwörter (Englisch): N-WASP, Astrocytes , Brain tumour
Basisklassifikation: 42.05
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Hahn, Ulrich (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 04.11.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 09.02.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Magnetisch induzierte zielgerichtete Zellmigration als neuer Ansatz für die Therapie von Glioblastoma multiforme
Diesem Thema lag die vorherrschende Problematik bei der Therapie von Glioblastoma multiforme (maligner Hirntumor Grad IV) zugrunde, dass trotz maximalem Standard-Therapieeinsatzes bestehend aus chirurgischer Entfernung des Haupttumors, Chemotherapie und Bestrahlung nur eine geringe Verbesserung der Überlebenschance von unter 2% nach 6 Monaten erzielt werden kann. Das Hauptproblem hierbei sind invasive infiltrierende Tumorzellen, die bei den oben genannten Therapieansätzen nicht erfaßt und entfernt werden können, da sie bereits ins umliegende Gewebe eingewandert sind.
Grundidee dieser Arbeit war es diese negative Eigenschaft der Glioblastomazellen auszunutzen, um diese zu positivem Zweck für die Therapie dieses Gehirnkrebses umzuwandeln. Hierfür wurden biokompatible magnetische Nanopartikel verwendet, die in die Zellen eingeschleust wurden. Nach Aufnahme der magnetischen Nanopartikel wurden die nun magnetisierbaren Zellen in einem externen Magnetfeld zur zielgerichteten Migration angeregt, um bei einer künftigen Anwendung am Patienten die Glioblastoma Zellen aus dem gesunden Gewebe zu separieren (Mucha 2009).
Sämtliche hierfür nötigen Parameter und die benötigte Beschaffenheit des Magnetfeldes mussten zu diesem Zweck etabliert werden. Ein permanentes Magnetfeld wurde entwickelt, dessen Magnetfluss auf die Zellebene konzentriert ist.
Die Aufnahme der Nanopartikel in die Zellen und deren Verträglichkeit, wurde an Glioblastomzellen und primären humanen Astrocyten (als Kontrollgruppe für gesundes Gewebe) unter in vitro Bedingungen mit und ohne Magnetfeld getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die verwendeten Ferrofluide von den Zellen konzentrationsabhängig aufgenommen werden und sehr gut verträglich für die Astrocyten sind (Avdeev, Mucha et al. 2010) während bei mehreren Glioblastom-Zelllinien eine signifikante Reduktion des Zellwachstums beobachtet werden konnte.
Mikroskopische Analysen der Zellorganell-Struktur demonstrierten eine konzentrationsabhängige Zunahme und Vergrößerung der Lysosomen, die bei den Glioblastomazellen wesentlich ausgeprägter ist und mit der Reduktion des Zellwachstums korrelierte. Analysen nach 24h Expositionszeit im Magnetfeld führten bei nanopartikelhaltigen Glioblastomazellen zu Polarisierung der Zellen mit Ausrichtung der Lysosomen zum magnetischen Gradienten, während Astrocyten keine Reaktion auf das Magnetfeld zeigten.
Mit Glioblastomazellen konnte das angestrebte Ziel einer zielgerichteten Migration erreicht und im Laufe der Arbeit stetig verbessert werden.
Immunhistochemische Analysen von Komponenten des Zytoskeletts und an deren Aufbau beteiligtem Protein N-WASP bestätigten, dass es sich hierbei um eine aktive Migration der Zellen handelt. Nanopartikelhaltige Krebszellen weisen im Magnetfeld nicht nur eine Starke Polarisierung zum Gradienten auf sondern zeigen eine sehr starke Aktivität von N-WASP und die Ausbildung vieler Filopodien. Diese aktive Migration wird durch die in den Zellen enthaltenen Nanopartikel Zugstress abhängig induziert und möglicherweise über den Cdc42 Signalweg gesteuert. Astrocyten hingegen zeigen keine Reaktion auf das Magnetfeld.
Die Ergebnisse zeigen das die magnetisch induzierte zielgerichtete Zellmigration für die Umsetzung als Therapie im Patienten sehr hoffnungsvoll ist, da die Eindringtiefe der invasiven Zellen durchschnittlich 2-3 cm um den Haupttumor beträgt und eine aktive Migration der Krebszellen für deren Separation benötigt wird.
Kurzfassung auf Englisch: Magnetically induced directed Cell Migration as a new Approach
for Therapy of Glioblastoma multiforme
The predominating problem investigated in this doctoral thesis has been the development of a therapy for dealing with Glioblastoma multiforme (malignant brain tumors of the type class 4). Despite all efforts including surgical removal of the main tumor, chemotherapy and irradiation, the chance of survival after 6 months still lies under 2%. This can be attributed to an inability of such therapies to completely eliminate invasive and migratory cancerous cells from in and around the near vicinity of the tumors.
Fundamental to this work has been the idea of employing the so called negative aspects of Glioblastoma behaviour, namely their ability to migrate and use this for positive therapeutic application against brain cancer. Here magnetically activated and biocompatible nanoparticles were transferred into the cells. Thereafter the cells were placed in a magnetic field where it was possible to induce actively migration of these cells in the direction of the magnetic field. For this to occur it was first necessary to investigate and establish parameters (inclusive here is cell culture) and necessary conditions for the magnetic field, whose flow had to be concentrated on the cell level.
The findings have led to a patent being filed (Mucha 2009) for future therapeutic application in removing Glioblastoma cells from the brain.
The thesis discusses findings with regard to the uptake of nano-particles in the cells and their compatibility concerning Glioblastoma cells and primary human astrocytes (as control group for healthy cells) under in vitro conditions, with and without influence of the magnetic field. The results demonstrate that the employed ferrous fluids are taken up concentration-dependent by the cells and are very compatible for use with astrocytes (Avdeev, Mucha et al. 2010), whereby it was also observed that several Glioblastoma cell-lines had a significant reduction in cell growth.
Microscopic analyses of the cell-organelle structure demonstrated a concentration-dependent increase and enlargement of the lysosomes, which are substantially more pronounced with the Glioblastoma cell, and further correlated with the reduction in cell growth.
Analyses after 24h exposure time to the magnetic field led nanoparticle rich glioblastoma cells to polarize with adjustment of the lysosomes to magnetic gradients, whereas astrocytes did not show a reaction to the magnetic field. Thus the goal of the study (purposeful migration of Glioblastoma cells) has been achieved and continuously improved throughout the course of this work.
Immunhistochemical analyses of components of the cytoskeleton and their structure involved protein N-WASP confirmed that an active migration of the cells takes place. Here nanoparticle containing cancer cells (0.25NP-MA) demonstrate not only a strong polarization in the direction of the magnetic field but also show very strong activity of N-WASP and the building of many Filopodia necessary for cell migration. This active migration is caused by the stress induced by these nanoparticles within the cells and is steered in all probability via the Cdc42 signal path. Astrocytes however do not show a reaction to the magnetic field.
The results clearly demonstrate that magnetically induced purposeful cell migration and its conversion as therapy for use in living patients is indeed promising, since the penetration depth of the invasive cells amounts to on average 1-3 cm around a main tumor and an active migration of cancer cells is needed a fundamental requirement for their extraction.

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