The Role of CD4+ T Cells in the Pathogenesis of Progressive Multifocal Leukoencephalopathy

Abstract

In this work CD4+ T cells are characterized that are involved in the immune defence against JC virus which is the causal agent of progressive multifocal leukoencephalopathy. In particular the role of CD4+ T cells during PML immune reconstitution inflammatory syndrome was addressed. The study provided evidence that CD4+ T cells are an essential part of the defence mechanisms against JCV. The examination of tissue-infiltrating leukocytes isolated from a brain biopsy of a PML patient with IRIS revealed that the majority of T cells had a CD4+ phenotype, although, CD8+ T cells are commonly thought to be the major cell type driving the immune response against JC virus. The isolated CD4+ T cells mainly consisted of IFN-γ-secreting Th1 cells and a cell type that was able to produce simultaneously IFN-γ and IL-4. Based on these findings these cells were subsequently termed bi-functional Th1-2 cells. Besides the secretion of IFN-γ and IL-4 these cells were able to upregulate the Th1- and Th2-specific transcription factors T-bet and GATA-3. Furthermore, Th1-2 cells were characterized by the expression of the chemokine receptors CXCR3, CCR5, and CCR4. Fine specificity analyses were conducted and revealed that the majority of CD4+ immunodominant epitopes were located within the major capsid-forming protein VP1. Another interesting aspect was the finding that the T cell composition in the brain highly differed from the composition in the CSF or peripheral blood. VP1-specific clones were hardly detectable in the CSF which is frequently taken as surrogate for the T cell composition of the hard accessible brain. T cell clones specific for VP1 were isolated in order to assess their specificity, HLA restriction, antigen avidity and TCR in more detail. Most T cell clones were able to interact with different MHC-class II molecules which can be of advantage in the central nervous system where MHC expression is limited. Due to the higher avidity these cross-restricted T cell clones were significantly more sensitive. However, DQB1*06:02 mono-restricted clones are not less efficient in JCV elimination implied by their strong expansion in the brain and their recognition of immunodominant epitopes. Based on this finding it is conceivable that HLA-DQ expression is elevated in the brain during PML-IRIS. Another observation was the accumulation of different T cell clones specific for an immunodominant epitope presented by DQB1*06:02 and a certain TCR Vα and Vβ chain combination. A functional T cell receptor consisting of this random combination of both chains might have an intrinsic affinity for this certain peptide-MHC complex, mediated by the invariant regions CDR1 and CDR2 of both chains which do not differ between the clones of this group. Conversely, the hypervariable CDR3 region seems to be important for the fine tuning of antigen recognition. In summary, multiple strategies for JCV-antigen recognition during PML-IRIS were identified that ensure efficient elimination of JC virus but as well might be involved in the excessive immune response in the brain causing the severe symptoms of the immune reconstitution inflammatory syndrome. The second part of the work focused on the characterization of the JC virus-specific immune response during an experimental vaccination attempt of a PML patient with underlying CD4 lymphocytopenia. To boost the patients insufficient immune response against the virus he was vaccinated with VP1 protein, an adjuvant containing a TLR7 agonist, and recombinant IL-7. The viral load in the serum declined to a non-detectable level after repeated vaccination. Furthermore, an increase of VP1-specific IgG antibodies was observed as well as the induction of VP1-specific CD4+ T cells with a Th1 memory phenotype. The disease progression could be stopped. Based on these findings vaccination with VP1 is a promising and easy applicable approach for the treatment of PML patients.

Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung von CD4+ T-Zellen, die involviert sind bei der Immunabwehr gegen das JC-Virus (JCV), dem Verursacher von progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie (PML). Insbesondere wurde die Rolle der CD4+ T-Zellen während des inflammatorischen PML-Immunrekonstitutionssyndroms (PML-IRIS) näher beleuchtet. Es konnte belegt werden, dass CD4+ T-Zellen eine zentrale Rolle bei der Bekämpfung dieses Virus einnehmen. Bei der Untersuchung gewebeinfiltrierender Leukozyten, isoliert aus der Hirnbiopsie eines PML Patienten mit IRIS, stellte sich heraus, dass es sich bei dem Großteil der T-Zellen um CD4+ Zellen handelte und nicht um CD8+ Zellen, die gemeinhin als Hauptagitatoren gegen das JC-Virus gelten. Diese CD4+ T-Zellen setzten sich hauptsächlich zusammen aus IFN-γ-sezernierenden Th1-Zellen und einem Zelltyp, der gleichzeitig IFN-γ und IL-4 produziert und daraufhin bifunktionaler Th1-2 Typ benannt wurde. Diese bifunktionalen Th1-2 Zellen sind, neben der gleichzeitigen Produktion von IFN-γ und IL-4, in der Lage die Th1- und Th2-spezifischen Transkriptionsfaktoren T-bet und GATA-3 exprimieren. Des Weiteren konnten diese Zellen über die Chemokinrezeptoren CXCR3, CCR5 und CCR4 charakterisiert werden. Neben dem Phänotyp wurde auch die Feinspezifität der hirngewebeinfiltrierenden CD4+ T-Zellen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass der Großteil der immundominanten Epitope innerhalb des VP1 Proteins lokalisiert sind, welches das Haupthüllprotein des Virus bildet. Ein weiterer interessanter Fund war die Tatsache, dass die T-Zellpopulationen im Gehirn sich stark unterschieden von denen im CSF oder peripheren Blut. VP1-spezifische Klone ließen sich kaum im CSF nachweisen, das häufig als Repräsentator für die T-Zellzusammensetzung für das schwerer zugängliche Hirngewebe angesehen wird. Durch die Generierung von VP1-spezifischen CD4+ T-Zellklonen konnte deren Feinspezifität, HLA-Restriktion, Antigensensitivität und T-Zellrezeptor genauer untersucht werden. Es stellte sich heraus, dass der Hauptteil der CD4+ T-Zellklone in der Lage war mit unterschiedlichen MHC-II Molekülen zu interagieren, was vor allem im Bereich des Zentralnervensystems mit seiner Limitierung der MHC-Expression einen Vorteil darstellen könnte. Durch die höhere Avidität zeigten diese kreuzrestringierten T-Zellklone eine signifikant höhere Antigensensitivität. Nichtsdestotrotz stellen die weniger sensitiven mono-restringierten T-Zellklone eine ebenso erfolgreiche T-Zellpopulation dar, die zu der am stärksten expandierten Population im Gehirn des PML-IRIS Patienten gehörte und immundominante Epitope aus der Peptidsequenz des JC-Virus erkannte. Dadurch, dass alle isolierten mono-restringierten Klone ihr spezifisches Peptid über das HLA Molekül DQB1*06:02 erkannten liegt die Vermutung nahe, dass die DQ-Expression relativ zur DR-Expression im Gehirn während PML-IRIS erhöht ist. Ein weitere interessante Beobachtung war die Anhäufung von verschiedenen T-Zellklonen mit Spezifität für ein immundominantes Epitop präsentiert durch DQB1*06:02 und einer bestimmten TCR Vα- und Vβ-Kettenkombination. Ein funktionierender T-Zellrezeptor, der aus der zufälligen Kombination dieser beiden Ketten entsteht, weist womöglich eine intrinsische Affinität zu dem bestimmten MHC-Peptidkomplex auf, die durch die invarianten CDR1- und CDR2-Regionen beider Ketten vermittelt wird und sich in allen Klonen dieser Gruppe nicht unterscheidet. Die hypervariable CDR3-Region hingegen hat in dieser Kombination eher modulatorischen Charakter. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass multiple Strategien zur JCV-Antigenerkennung im Gehirn während der PML-IRIS existieren, die eine effiziente Eliminierung des Virus gewährleisten und gleichzeitig zu der überschießenden Immunantwort im Gehirn beitragen, die zu den schweren Symptomen des Immunrekonstitutionssyndroms beitragen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung der Entwicklung einer JC-virusspezifischen Immunantwort nach einem individuellen Heilversuch an einem Patienten mit PML und idiopathischer CD4-Lymphozytopenie. Um die unzureichende Immunantwort des Patienten gegen das JC-Virus zu stärken erhielt er eine Vakzine bestehend aus VP1-Protein, einem TLR-7-haltigen Adjuvans und rekombinantem IL-7. Nach mehrmaliger Impfung sank die JC-Viruslast im Serum auf ein nicht-detektierbares Level und es war ein Anstieg der VP1-spezifischen IgG-Antikörper feststellbar, sowie eine Induktion von VP1-spezifischen CD4+ T-Zellen mit einem Th1 Memory Phänotyp. Die Krankheitsprogression konnte gestoppt werden. Die VP1-Vakzinierung stellt somit einen vielversprechenden Heilansatz bei der Therapie von PML dar.