Untersuchung der ADP-induziertenTyrosinphosphorylierung in humanen Thrombozyten

Abstract

Die Phosphorylierung von Tyrosinresten ist ein wesentlicher Bestandteil der ADP-induzierten Aggregation von Thrombozyten. Das Verständnis über intrazelluläre Signalmechanismen ist für die Bestimmung des Blutungsrisikos z. B. bei der präoperativen Behandlung mit Aggregationshemmern sowie zur Beschreibung pharmakologischer Funktionalität unablässlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals alle 120 beschriebenen SH2-Domänen exprimiert und in Bezug auf ihr Bindungsverhalten charakterisiert, um sie als funktionelle Sonden zur globalen Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung in Thrombozyten einsetzen zu können. Für 67 SH2-Domänen wurde eine Phosphotyrosin-abhängige Aktivität in zwei unabhängigen Testsystemen gezeigt und die Bindungsselektivität der Domänen bestimmt. Auf Basis dieser Daten wurden für eine Untersuchung der Tyrosinphosphorylierung in Thrombozyten 31 SH2-Domänen ausgewählt und in einer far-Western-Blot-Analyse 136 Tyrosinphosphorylierungsereignisse mit unterschiedlichen Kinetiken detektiert. Mit Hilfe von 15 repräsentativen SH2-Domänen lassen sich darüber hinaus Aussagen über die zeit- und stimulusabhängigen, Rezeptor-spezifischen Tyrosinphosphorylierungen treffen. Zur Identifizierung der in der far-Western-Analyse detektierten Proteine wurde ein SH2- Domänen-Pulldown mit massenspektrometrischer Proteinidentifizierung etabliert und angewendet. Mit vier SH2-Domänen wurden 285 Proteine identifiziert. Nach einer Auswahl über selektive Hintergrundkontrollen und das Anlegen von Qualitätsmerkmalen an die Identifizierung erfolgte eine Fokussierung auf 28 Kandidatenproteine. Die ausgewählten Proteine wurden einer unabhängigen Validierung mittels Western-Blot und Immunpräzipitation unterzogen und die massenspektrometrischen Ergebnisse überprüft. Die gewählte Strategie des Pulldowns mit massenspektrometrischer Proteinidentifizierung ergänzt den deskriptiven Ansatz des far-Western-Blots um eine SH2-Domänen-basierte Proteinidentifikation. Die validierten Ergebnisse der Identifizierung erlauben eine parallele Beschreibung diverser, ADP-induzierter Phosphorylierungsereignisse in Thrombozyten mit nur einer Phosphotyrosin-spezifischen Sonde. Eine Zuordnung beobachteter SH2-Bindungskinetiken und Regulationen zu identifizierten Proteinen kann somit eindeutig erfolgen.

Tyrosine phosphorylation plays a crucial role in ADP-induced platelet aggregation. The understanding of induced intracellular signaling cascades is from outstanding interest, for instance, to monitore prae-surgical anticoaggulant therapy and individual drug response during pharmacological treatment. In this thesis all human 120 SH2-domains were expressed and characterized in terms of functionality and binding characteristics, in order to use them as phosphotyrosine specific probes in the analysis of ADP stimulated platelets. For 67 SH2-domains the phosphotyrosine dependent binding activity and binding specifity was succesfully demonstrated in two independent assays. Based on these data 31 SH2-domains were used in a global approach to achieve detailed description of ADP-induced tyrosine phosphorylation in platelets whereby different phosphorylation kinetics for 136 proteins were discovered. Receptor-specific, time- and stimuli-dependent tyrosine phosphorylation in platelets can be comprehensively mirrored by SH2-domain profiling with a collection of 15 representative SH2-domains. To identify the discovered phosphorylated proteins a SH2-domain pulldown coupled with protein identification by mass spectrometry was established. In total, 285 proteins were detected by four SH2-domains and after ranking by specific background controls and quality criteria based on protein identification 28 candidate proteins were further analyzed. These proteins were independently investigated by Western blotting and immunprecipitation to validate results of mass spectrometry analysis. The described SH2-domain pulldown strategy combines descriptive far-Western blot analysis with SH2-domain based protein identification. The validated results of mass spectrometry analysis enables a parallel description of ADP-induces tyrosine phosphorylation in platelets with only one phosphotyrosine specific probe, conceding a correlation of phosphorylation kinetics and regulation of identified proteins by tyrosine phosphorylation.