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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-56123
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5612/


Influence of Phosphorylation on the Pathological Conformation of Human Microtubule Associated Protein Tau

Einfluss der Phosphorylierung auf die pathologische Konformation von humanem Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau

Chinnathambi, Subashchandrabose

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Tau-Protein , Gepaarten helikalen Filamente , Alzheimer Krankheit , Proteinfaltung , Aggregation
Freie Schlagwörter (Englisch): Tau protein, Tau Aggregation , Paired helical filaments , Alzheimers Disease , Protein folding
Basisklassifikation: 42.00
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mandelkow, Eckhard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.09.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 18.04.2012
Kurzfassung auf Englisch: Tau is one of the microtubule associated proteins which can bind and stabilize microtubules. It is classified as a natively unfolded protein. It has a very low content of secondary structural elements. Tau aggregates into insoluble fibers called paired helical filaments in Alzheimer’s disease. The residual folding and intramolecular interactions within tau are largely unknown, and the factors contributing to the formation and stability of PHFs and different morphologies of PHFs are not well understood.
The results of the present studies are aimed at better understanding of the effect of phosphorylation on the aggregation propensity and tau microtubule interaction.
The effect of phosphorylation sites in the KXGS motifs within the repeats and in the SP/TP motifs of the flanking regions were studied. We also studied tau fibril
polymorphism by Electron Microscopy and Atomic Force Microscopy. We further studied tau in solution by increasing temperature using different biophysical methods (CD spectroscopy, static and dynamic light scattering and small angle x-ray scattering). These observations could form a basis for elucidating the molecular and physiological role of phosphorylation at the repeat domains and in the flanking regions. The results are summarized as follows
(i) The pseudo-phosphorylation of KXGE motifs within the repeat domains of tau has a strong negative effect on both the tau-microtubule interaction and the aggregation into paired helical filaments. KXGE mutants on the basis of three repeat domain and four repeat domain constructs show a low tendency to aggregate and form amorphous aggregates instead of PHFs. Pseudo-phosphorylation in the SP/TP motifs in the N- and C-terminal domains of the flanking regions has only a moderate effect, both on the tau-microtubule interaction and on the aggregation into paired helical filaments. Overall, the results show that the physiological tau-microtubule interaction and the pathological tau-tau interaction similarly can be influenced by phosphorylation.
(ii) The combined pseudo-phosphorylation of AT8* and PHF1 sites leads to compaction of the paperclip conformation, such that the N-terminus approaches the repeat domain. When the Cterminus tail is cleaved from tau, the compaction becomes even stronger by combining pseudophosphorylated AT8*, AT100, and PHF1 epitopes. This is accompanied by a strong increase in the reaction with conformation-dependent antibodies MC1 and Alz-50, suggesting the generation of a pathological conformation characteristic of tau in AD. Furthermore, the compact paperclip conformation enhances the aggregation propensity to paired helical filaments but has little effect on microtubule interactions. Discussion 89
(iii) High resolution atomic force and electron microscopy were employed to study fibrils
assembled from different human tau isoforms and domains. All fibrils reveal structural
polymorphism: the “thin twisted” and “thin smooth” fibrils resemble flat ribbons
(cross-section ~10 x 15 nm) with diverse twist periodicities. “Thick fibrils” show periodicities of ~65-70 nm and thicknesses of ~9-18 nm as routinely reported for
“paired helical filaments” but structurally resemble heavily twisted ribbons.
Therefore, thin and thick fibrils assembled from different human tau isoforms challenge current structural models of paired helical filaments. The full-length tau and repeat domain constructs assemble into fibrils of similar thickness, the “fuzzy coat” of tau protein termini surrounding the fibril axis is nearly invisible for atomicforce microscopy and electron microscopy, presumably because of its high flexibility.
(iv) The unfolded nature of tau protein allows it to adopt either more extended or compact conformations. It is intriguing to speculate that the compaction and memory effect observed after rapid heating/cooling may be related to the compaction observed upon hyperphosphorylation, characteristic of incipient neuronal degeneration in AD. The “memory effect” is observed with full-length tau, but not with the repeat domain alone, suggesting that the interplay between domains in the whole protein might be responsible for the effect. One possible explanation could be the interplay between the acidic N-terminal domain (which varies among the tau isoforms due to alternative splicing) and the basic repeat domain (which also differs between the isoforms).
Kurzfassung auf Deutsch: Tau gehört zu der Gruppe der Mikrotubuli-assoziierten Proteine, es bindet an Mikrotubuli und stabilisiert diese. Zudem gehört Tau zur Klasse der nativ ungefalteten Proteine und weist nur einen geringen Anteil von Sekundärstruktur auf. Tau aggregiert zu unlöslichen Fasern, die man in der Alzheimer-Krankheit als paarige helikale Filamente (paired helical filaments, PHF) bezeichnet. Die verbleibende Faltung und die intramolekularen Interaktionen im Tau-Protein sind größtenteils unbekannt. Auch die Faktoren, die zur Bildung und Stabilität der PHFs beitragen, sowie die verschiedenen Morphologien der PHFs sind noch nicht hinreichend erforscht.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Phosphorylierung von Tau auf die Aggregations-Wahrscheinlichkeit und auf die Interaktion von Tau und Mikrotubuli genauer zu untersuchen. Dazu wurde der Effekt der Pseudo-Phosphorylierung in den KXGS-Motiven innerhalb der Tau-repeat-Region und in den SP/TP-Motiven der flankierenden Regionen untersucht. Desweiteren wurde mit elektronenmikroskopischen Methoden und mit Hilfe der Rasterkraft-Mikroskopie der Polymorphismus der Tau-Fibrillen analysiert. Unter Verwendung verschiedener biophysikalischer Methoden (CD-Spektroskopie, statische und dynamische Lichtstreuung und Röntgen-Kleinwinkelstreuung) wurde das Verhalten des Tau-Proteins in Lösung bei steigender Temperatur untersucht. Die in dieser Arbeit beschriebenen Beobachtungen könnten eine Grundlage zur Klärung der molekularen und physiologischen Rolle der Phosphorylierung in den repeat-Regionen und in den flankierenden Regionen bilden.

Zusammenfassend beinhalten die Ergebnisse dieser Arbeit:
(i) Die Pseudo-Phosphorylierung von KXGS-Motiven innerhalb der repeat-Region von Tau hat einen starken negativen Einfluss sowohl auf die Tau-Mikrotubuli-Interaktion als auch auf die Aggregation zu PHFs. KXGE-Mutanten, die auf 3-repeat- und 4-repeat-Konstrukten basieren, zeigen eine geringe Neigung zur Aggregation und formen eher amorphe Aggregate als PHFs. Die Pseudo-Phosphorylierung in den SP/TP-Motiven der N- und C-terminalen Domänen der flankierenden Regionen hat nur einen moderaten Effekt auf die Tau-Mikrotubuli-Interaktion und auf die Bildung von PHFs. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass sowohl die physiologische Tau-Mikrotubuli-Interaktion als auch die pathologische Tau-Tau-Interaktion durch die Pseudo-Phosphorylierung beeinflusst werden.
(ii) Die kombinierte Pseudo-Phosphorylation an den AT8*- und PHF1-Bindungstellen führt zu einer kompakteren Faltung, zur sogenannten paperclip-Konformation des Tau-Proteins, bei der sich der N-Terminus der repeat-Region nähert. Wird das C-terminale Ende von Tau abgespalten, verstärkt sich diese Kompaktion weiter, wenn gleichzeitig die AT8*-, die AT100- und die PHF1-Stellen pseudo-phosphoryliert vorliegen. Dieser Effekt geht einher mit einer verstärkten Bindung der konformations-spezifischen Antikörper MC1 und Alz-50, was auf die Entstehung einer pathologischen Konformation hindeutet, wie sie für die Alzheimer-Krankheit typisch ist. Desweiteren verstärkt die kompakte paperclip-Konformation die Aggregations-Wahrscheinlichkeit, hat aber wenig Einfluss auf die Interaktion mit Mikrotubuli.
(iii) Um die Entstehung von Fibrillen aus verschiedenen humanen Tau-Isoformen und Tau-Domänen zu verfolgen, wurde die hochauflösende Rasterkraft-Mikroskopie eingesetzt. Ein struktureller Polymorphismus zeigt sich für alle Fibrillen: Dünne, verdrillte (“thin twisted”) und dünne, glatte (“thin smooth”) Fibrillen ähneln flachen, unterschiedlich stark verdrehten Bändern mit einem Querschnitt von ca. 10 x 15 nm. „Dicke Fibrillen“ haben eine Periodizität von 60-70 nm und einen Durchmesser von 9-18 nm (ähnliche Werte werden üblicherweise auch für PHFs angegeben), gleichen aber strukturell stark verdrillten Bändern. „Dünne“ und „dicke“ Fibrillen aus verschiedenen humanen Tau-Isoformen stellen daher das bestehende Struktur-Modell der PHFs in Frage. Das vollständige Tau und die Konstrukte verschiedener Domänen bilden Fibrillen ähnlicher Dicke. Der sogenannte “fuzzy coat“ , der die Fibrillenachse umgibt und der aus den losen Enden der Tau-Moleküle besteht, ist für Rasterkraft- und Elektronenmikroskopie nahezu unsichtbar, was vermutlich an der hohen Flexibilität der Tau-Protein-Enden liegt.
(iv) Die ungefaltete Natur des Tau-Proteins erlaubt sowohl ausgedehnte als auch kompakte Faltungszustände. Die Vermutung liegt nahe, dass die Verdichtung und der „Gedächtnis-Effekt“, welcher sich nach schnellem Erwärmen und Abkühlen beobachteten lässt, mit der Kompaktion zusammenhängen, die bei Hyperphosphorylierung auftritt und die für die beginnende neuronale Degeneration bei der Alzheimer-Krankheit charakteristisch ist. Die Tatsache, dass der „Gedächtnis-Effekt“ sich für das vollständige Tau beobachten lässt, nicht jedoch für die repeat-Domänen alleine, lässt vermuten, dass ein Zusammenwirken der Domänen innerhalb des Tau-Proteins für diesen Effekt verantwortlich ist. Eine mögliche Erklärung dafür könnte sein, dass die sauere N-terminale Domäne (welche aufgrund des alternativen splicings zwischen den Tau-Isoformen variiert) und die basische repeat-Domäne (die sich ebenfalls bei den Isoformen unterscheidet) miteinander interagieren

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