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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-56171
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5617/


Detektion und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut von Patientinnen mit Ovarialkarzinom

Detection and Characterization of Circulating Tumor Cells in the Peripheral Blood of Ovarian Cancer Patients

Alpers, Iris

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Ovarialkarzinom , Eierstockkrebs , zirkulierende Tumorzellen , CTC, minimale residuale Krebserkrankung , EpCAM
Basisklassifikation: 44.81 , 42.20 , 42.13 , 42.15 , 44.92
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pantel, Klaus (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 18.04.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Das Ovarialkarzinom wird bei 75 % der Patientinnen erst in einem fortgeschrittenen Stadium (FIGO Stadium III und IV) diagnostiziert, da es keine Frühsymptome zeigt und sensitive Tumormarker bislang nicht verfügbar sind. In diesen späten Krankheitsstadien hat sich der Tumor bereits im Peritoneum ausgebreitet, welches eine umfangreiche chirurgische Behandlung und eine aggressive Chemotherapie notwendig macht. Bislang fehlen Parameter, die ein Wiederauftreten der Krebserkrankung und das Ansprechen auf die Chemotherapie anzeigen. Ziel ist es, den Therapieerfolg zum Zeitpunkt der Diagnose zu prognostizieren. So kann die Therapie der einzelnen Patientinnen auf die Aggressivität und Resistenz des Tumors hin angepasst werden. Der Nachweis und die molekulare Charakterisierung von im Blut zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) könnte hierbei einen wichtigen Beitrag leisten und helfen, den Mechanismus der intraperitonealen Ausbreitung sowie der Fernmetastasierung des Ovarialkarzinoms besser zu verstehen.
In dieser Arbeit wurden CTCs im Blut von Patientinnen mit Ovarialkarzinom durch Dichtegradientenzentrifugation sowie auf einer EpCAM (epitheliales Zelladhäsions-molekül)-basierenden Zellseparation angereichert. Der CTC Nachweis erfolgte über epithelspezifische Zytokeratinproteine (CK 5/7/8/18). Zum Zeitpunkt der Operation wurden in 3,6 % (5 von 139) der Proben CTCs nachgewiesen, während sechs Monate nach Therapie in keiner (0 von 56) der Proben CTCs detektiert wurden. Die niedrigen Detektionsraten sowie die Expressionsergebnisse der Markerantigene von Primärtumor, Metastasen und Asziteszellen deuten darauf hin, dass die CTCs die Protein-Expression der epithelialen Marker verlieren und somit der Detektion entgehen können. Daher wurde in dieser Arbeit erfolgreich eine neue Methode für den Nachweis von CTCs etabliert, indem auf die EpCAM-basierende Anreicherung verzichtet wurde. Mit Hilfe der optimierten Nachweismethode wurden die CTCs durch mehrere Markerantigene (Zytokeratin 5/7/8/18, EpCAM, HER-2, EGFR, EMA) detektiert. Aufgrund der deutlich verbesserten Sensitivität erhöhten sich die Detektionsraten auf 26,3 % (30 von 112) für die Proben zum Zeitpunkt der Operation und auf 7,6 % (6 von 79) für die Proben sechs Monate nach Therapie.
Es zeigte sich, dass zum Zeitpunkt der Operation der positive CTC-Status signifikant mit dem Vorhandensein von Fernmetastasen korrelierte (p-Wert: 0,006), was die klinische Relevanz der CTCs für die Fernmetastasierung des Ovarialkarzinoms belegte. In Blutproben, die sechs Monate nach der Therapie abgenommen wurden, war der positive CTC-Status signifikant mit einem kürzeren krankheitsfreien Überleben assoziiert (p-Wert 0,0001).
Für die Untersuchung genetischer Aberrationen wurden Fluoreszenz in situ Hybridisierungs-Analysen (FISH-Analysen) für die Chromosomenbereiche 3q26 und 8q24 durchgeführt. Diese Abschnitte eignen sich besonders, da in therapieresistenten Tumoren für diese Bereiche häufig ein chromosomaler Zugewinn vorliegt. Anhand der FISH-Analysen konnte gezeigt werden, dass die immunzytochemisch detektierten Zellen genetische Aberrationen aufwiesen, was den malignen Ursprung dieser Zellen bestätigte. Außerdem wurden Zellen mit chromosomalem Zugewinn identifiziert, welche die Markerproteine nicht exprimierten. Somit zeigte sich, dass eine Subpopulation der CTCs die epithelialen Marker nicht exprimieren.
Aufgrund der hohen Anzahl von CTCs einer Probe konnten diese bezüglich der Expression der Markerproteine untersucht werden. Es zeigte sich, dass die CTCs nicht alle Markerproteine exprimierten und heterogen bezüglich der Proteinexpression waren. Über 90 % der CTCs dieser Probe waren negativ für EpCAM, während der kleinere Anteil EpCAM schwach exprimierte. Der Phänotyp der Zellen der Metastasen mit geringer EpCAM-Expression entsprach dem Großteil der CTCs und belegte somit die Hypothese, dass die EpCAM-Expression der CTCs beim Ovarialkarzinom nicht stabil ist.
Es lässt sich zusammenfassend sagen, dass die CTCs sehr heterogen bezüglich chromosomalen Veränderungen und der Proteinexpression sind. Vergleichend mit Zellen des Primärtumors, scheinen die epithelialen Marker, insbesondere EpCAM, in CTCs vermindert vorzuliegen. In dieser Arbeit konnten somit erstmalig die CTCs des Ovarialkarzinoms genotypisch als auch phänotypisch vergleichend mit Primärtumor, Metastasen und Asziteszellen charakterisiert und ihre klinische Relevanz untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen maßgeblich dazu bei, das Wissen über die Bedeutung sowie die klinische Relevanz der CTCs und die Disseminierung beim Ovarialkarzinom zu erhöhen.

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