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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-56202
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5620/


Untersuchungen zur epigenetischen Regulation der humanen Cancer-Testis MAGE-A Gene

Tadewaldt, Josefine

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Krebs , MAGE-A , BORIS , Epigenetik
Basisklassifikation: 44.81 , 42.20 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pantel, Klaus (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 02.03.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 25.04.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Während der Karzinogenese spielen epigenetische Veränderungen eine zentrale Rolle, die durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren gesteuert werden. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Regulation der Cancer-Testis Antigenfamilie MAGE-A, die häufig in verschiedenen Tumorentitäten exprimiert wird. Aufgrund ihrer Tumorspezifität könnten sie für die antitumorale Immuntherapie relevant sein. Jedoch ist der genaue Regulationsmechanismus der MAGE-A Gene bisher noch nicht vollständig geklärt. So könnte neben der DNA-Methylierung auch ein direkter Einfluss des Cancer-Testis Antigens BORIS auf die Änderung des Methylierungsmusters vorliegen. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Rolle von BORIS zusammen mit Transkriptionsfaktoren sowie epigenetischen Faktoren auf die Expression der tumorassoziierten MAGE-A Antigene (A1, A2, A3 und A12) untersucht. Außerdem sollte zum besseren Verständnis geklärt werden, ob BORIS Einfluss auf die epigenetischen Mechanismen der DNA-Methylierung und der Histonmodifizierungen an den MAGE-A-Promotoren nehmen kann.
Zunächst wurde die Expression von BORIS und/oder MAGE-A in verschiedenen Krebszelllinien (Brust, Prostata, Leukämie, Leber und Kolon) und den mikrometastatischen Zelllinien mittels semiquantitativer RT-PCR untersucht. Dabei zeigte sich, dass die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte BORIS-Expression nicht mit den durch Wischnewski et al. durchgeführten MAGE-A-Expressionsananlysen korrelierte. Somit kann ein direkter Zusammenhang zwischen der Expression der MAGE-A Gene und dem BORIS Gen ausgeschlossen werden. Jedoch muss erwähnt werden, dass bei der Expression der MAGE-A Gene in den BORIS-negativen Zelllinien nicht alle BORIS-Splicevarianten berücksichtigt wurden. Nach Zugabe des DNA Demethylierungsagens 5-Aza-2’-Deoxycytidin und/oder des Histondeacetylase-Inhibitors Trichostatin A kam es auch in den zuvor negativen Zelllinien sowohl zu einer BORIS- als auch zu einer MAGE-A-Expression. Dies lässt auf eine Inhibierung der Expression durch Hypermethylierung der Promotorregionen schließen.
In den folgenden transienten Transfektionsstudien wurden MAGE-A-negative Zelllinien sowohl mit Reporter- als auch mit verschiedenen Expressionsplasmiden transfiziert, um den regulatorischen Einfluss von BORIS zusammen mit weiteren Faktoren auf die MAGE-A Genexpression zu ermitteln. Dabei zeigte sich, dass die Transkriptionsfaktoren Ets-1 und Sp1 die MAGE-A-Expression in der Brustkrebszelllinie und den mikrometastatischen Zelllinien heraufregulieren konnten. Jedoch blieb es beiden Faktoren versagt, die MBD1v1-vermittelte Repression aufzuheben. Vielmehr war BORIS in der Lage die hypermethylierten MAGE-A-Promotoren zu stimulieren, was sich in einer gesteigerten MAGE-A-Aktivität widerspiegelte. Eine gemeinsame Überexpression des Transkriptionsfaktors Sp1 und BORIS konnte die BORIS vermittelte MAGE-A-Expression nicht weiter stimulieren. Stattdessen wurde ein reprimierender Effekt beobachtet. Um die molekulare Ursache für die Repression der BORIS-vermittelten MAGE-A Aktivierung durch Sp1 zu ergründen, wurden EMSAs (electro mobility shift assay) durchgeführt. Die Tatsache, dass beide Proteine an die potentiell gleiche Bindungsstelle upstream des unmethylierten MAGE A1-Promotors binden, unterstreicht die Bedeutung der Beobachtung.
Als weitere potentielle Mechanismen der entgleisten Regulation der MAGE-A Gene durch BORIS wurde die Promotormethylierung sowie Aspekte der Chromatinstruktur untersucht. Mit Hilfe der Methoden der Bisulfit-Sequenzierung und der Chromatin-Immunpräzipitation wurde gezeigt, dass BORIS keinen direkten molekularen Einfluss auf die epigenetischen Mechanismen der DNA-Methylierung und die Modifikationen der am MAGE-A1-Promotor gebundenen Histone hat. Hinsichtlich dieser Ergebnisse kommt BORIS im Rahmen dieser Arbeit nicht als potentielles Demethylierungsagens in Frage.
Im Zuge durchgeführter Protein-Protein-Interaktionsstudien konnten auch molekulare Zusammenhänge mit dem TATA-Box-bindenden Protein (TBP) und den Transkriptionsfaktoren sowie epigenetischen Faktoren bezüglich der Aktivierung der MAGE-A-Promotoren aufgedeckt werden. Durch diese Methode gelang es, eine direkte Interaktion von Sp1 mit Ets-1, MBD1v1 als auch der N-terminalen Domäne des TBP nachzuweisen. Ferner konnte erstmals in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die C terminale, evolutionär konservierte Domäne des TBP mit BORIS und MBD2b interagierte.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass BORIS in den verschiedenen Tumorentitäten eine Rolle in der MAGE-A Aktivierung spielt. Eine direkte Einflussnahme auf das DNA-Methylierungsmuster der Promotoren und die Histonmodifikationen wurde nicht beobachtet. Vielmehr sind Wechselwirkungen mit verschiedenen Transkriptionsfaktoren und dem basalen Transkriptionsapparat wahrscheinlich entscheidend, um die MAGE-A Gene im Verlauf der Karzinogenese zu regulieren.




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