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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-57133
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5713/


Structural and functional analyses of IgE epitopes and their biological relevance

Strukturelle und funktionelle Analysen von IgE Epitopen und ihrer biologischen Relevanz

Michel, Yvonne

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SWD-Schlagwörter: Immunglobulin E , Allergie , Allergen , Epitop , Antikörper , Biene
Freie Schlagwörter (Deutsch): alpha-Gal , Api m 6 , Api m 1 , CCD , rekombinant
Freie Schlagwörter (Englisch): epitope , hypersensitivity , allergy , antibody , interaction
Basisklassifikation: 42.13 , 44.45 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Bredehorst, Reinhard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.05.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 27.07.2012
Kurzfassung auf Englisch: So far, the detailed knowledge of complex interactions of antibodies with their corresponding epitopes and the essential requirements for triggering complex mechanisms, especially in pathophysiological backgrounds like allergies, is only restricted. One reason for this deficit is the lack of monoclonal human antibodies, especially of the allergy relevant isotype IgE, occurring only with very low concentrations in the human serum and therefore turning the identification, characterization and interaction analysis of epitopes into a major challenge. Furthermore the availability of allergenic target structures and a precise knowledge about their properties on a molecular level are essential to understand allergic reactions in more detail. At present, available recombinant technologies open up a wide range of possibilities to obtain detailed molecular insights into complex binding patterns of antibodies to their antigens.
The aim of this work was the evaluation of B cell IgE epitopes and their biological relevance by investigations of antibody interactions with their antigens, using recombinant methodologies on different molecular levels in the context of allergy. One of the major reasons for IgE-mediated anaphylaxis are hypersensitivities due to hymenoptera venoms, which represent an ideal clinical condition for studying type I allergic reactions. The hymenoptera venom allergens Api m 1 and Api m 10 were recombinantly produced in different cell lines resulting in proteins with a varying degree of cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs). They were used as tools for precise analyses of specific patients IgE reactivities against CCDs or peptidic epitopes and for a detailed reactivity dissection recombinant approaches could be established. Additionally the evaluation of the significance of the new venom component Api m 10 and the assessment of its allergenicity was possible. The low molecular weight honeybee venom allergen and putative protease inhibitor Api m 6 was immunochemically characterized and its function could be underlined by molecular modeling. Interestingly, despite its small size the protein exhibited an explicit IgE-sensitizing potential.
An authentic B cell epitope of the clinically relevant major timothy grass pollen allergen Phl p 5 was characterized using a specific fully human IgE antibody. Therefore Phl p 5 fusion proteins and recombinant IgE were generated and evaluated in immunoblotting and mediator release assays. The epitope could be described as a defined loop region exclusively present in the isoform Phl p 5a, contradicting the hypothesis that IgE epitopes are preferably defined by large surface areas as shown in only two crystal structures so far. Furthermore the first full set of Phl p 5-specific allergy-related antibody isotypes was generated, representing valuable tools for investigations of fundamental mechanisms and structure/function relationships in allergy.
For the first time direct molecular insights into the interaction of the clinically relevant structure alpha-Gal with a recombinant IgE antibody as well as human serum immunoglobulins were obtained. Mapping the detailed footprint by STD-NMR the recognition patterns of the antibodies and the carbohydrate-epitope could be shown on atomic level, but in cellular degranulation assays no activation was achieved using the IgE. Against the background of hapten-specific antibodies, monoclonal TNP-specific IgE constructs were generated. By characterization of functional features of the antibodies performing SPR-analyses and cellular degranulation assays a suitable model system for detailed analyses of hapten/antibody interactions with defined experimental conditions could be established. This can give new insights in the molecular interplay of antibodies or proteins with low molecular target structures, such as CCDs.
The results of this work can contribute to a better understanding of complex interactions of antibodies with their antigens and help elucidating the nature of B cell epitopes.
Kurzfassung auf Deutsch: Das Wissen über komplexe Wechselwirkungen von Antikörpern mit ihren spezifischen Epitopen, sowie über die notwendigen Voraussetzungen, die insbesondere vor pathophysiologischen Hintergründen wie Allergien zur Induktion komplexer Mechanismen führen, ist nach wie vor begrenzt. Ein Grund dieses bestehenden Defizits ist die stark eingeschränkte Verfügbarkeit monoklonaler Antikörper, speziell des allergierelevanten Isotyps IgE, der im humanen Serum in nur sehr geringen Konzentrationen vorkommt und daher die Identifikation, Charakterisierung und Interaktionsanalyse von Epitopen zu einer großen Herausforderung macht. Des Weiteren sind das ausreichende Vorhandensein allergener Zielstrukturen und umfassende Kenntnis über deren Eigenschaften auf molekularer Ebene essentiell, um allergische Reaktionen im Detail zu verstehen. Eine Anzahl derzeit zugänglicher rekombinanter Technologien eröffnet umfangreiche Möglichkeiten um detaillierte Einblicke in komplexe Bindungsmuster von Antikörpern an ihre Antigene zu erhalten.
Ziel dieser Arbeit war die Evaluierung von B Zell IgE Epitopen und ihrer biologischen Relevanz durch ausführliche Untersuchungen von Antikörper/Antigen Interaktionen im Kontext der Allergie und mittels rekombinanter Methodiken auf unterschiedlichen molekularen Ebenen.
Einer der Hauptgründe für IgE-vermittelte Anaphylaxien sind Hypersensitivitäten auf Grund von Hymenopterengiften, welche diesbezüglich ein geeignetes Krankheitsbild für Untersuchungen der Typ-I Allergie darstellen. Die Hymenopterengiftallergene Api m 1 und Api m 10 wurden rekombinant in unterschiedlichen Zelllinien produziert, woraus Proteine mit einem unterschiedlich hohem Grad angefügter kreuzreaktiver Kohlenhydrat-Determinanten (CCDs) hervorgingen. Diese wurden für eingehende Untersuchungen zur Differenzierung der IgE Reaktivitäten von Patientenseren mit CCDs und peptidischen Epitopen eingesetzt und es konnten rekombinante Ansätze für umfassende Reaktivitätsanalysen etabliert werden. Außerdem war es möglich die Signifikanz der kürzlich beschriebenen Bienengiftkomponente Api m 10 zu evaluieren und die Allergenität des Antigens zu bewerten. Das Minorallergen Api m 6, eine Bienengiftkomponente mit niedrigem Molekulargewicht und einer putativen Funktion als Proteaseinhibitor, wurde immunchemisch charakterisiert und mittels molekularem Modeling konnten Struktur-Funktions-Beziehung beschrieben werden. Interessanterweise zeigte das Protein trotz seiner geringen Größe ein eindeutiges Potenzial zur IgE Sensibilisierung.
Unter Einsatz eines spezifischen, vollständig humanen IgE Antikörpers wurde ein authentisches B Zell Epitop des klinisch relevanten Majorallergens Phl p 5 des Wiesenlieschgrases charakterisiert. Dazu wurden zunächst Phl p 5 Fusionsproteine sowie rekombinante IgE Antikörper generiert und im Immunoblot und zellulären Degranulations-assays evaluiert. Das Epitop konnte auf eine exklusiv in der Isoform Phl p 5a vorkommende Schleifenregion eingegrenzt werden, was der Hypothese widerspricht, wonach IgE Epitope vor allem durch ausgedehnte Bereiche an Proteinoberflächen definiert sind, wie bislang anhand zweier Kristallstrukturen gezeigt werden konnte. In diesem Zusammenhang wurde ein vollständiges Set allergierelevanter Antikörperisotypen mit Spezifität für Phl p 5a generiert, womit sehr nützliche Hilfsmittel für weitere Untersuchungen fundamentaler Mechanismen der Allergie sowie von Struktur-Funktions-Beziehungen zur Verfügung stehen. Erstmalig konnten molekulare Einblicke in die Interaktion der klinisch relevanten CCD Struktur alpha-Gal mit einem rekombinanten IgE Antikörper, sowie mit humanen Serum-Immunglobulinen erhalten werden. Durch detailliertes Epitop-Mapping mittels STD-NMR wurde das Bindungsmuster der Antikörper an das Kohlenhydrat-Epitop auf atomarer Ebene erhalten. Der monoklonale IgE zeigte im Degranulations-assay jedoch keine inhärente Fähigkeit zur zellulären Aktivierung.
Vor dem Hintergrund hapten-spezifischer Antikörper wurden TNP-bindende IgE-Konstrukte dargestellt. Die funktionellen Eigenschaften der Antikörper konnten in SPR-Analysen und in zellulären Degranulations-assays charakterisiert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten passende Modellsysteme für die detaillierte Analyse von Hapten/Antikörper Interaktionen unter definierten experimentellen Bedingungen etabliert werden, wodurch neue Einblicke in die molekularen Wechselwirkungen von Antikörpern oder Proteinen mit niedermolekularen Zielstrukturen, wie z.B. CCDs, erhalten werden können. Die dadurch erhaltenen Ergebnisse stellen die Grundlage für ein besseres Verständnis komplexer Interaktionen von Antikörpern mit ihren Antigenen dar und können zur Aufklärung der Beschaffenheit von B Zell Epitopen beitragen.

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