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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-57242
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5724/


Untersuchung des Einflusses von extrazellulärem Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+) auf regulatorische T Zellen der Maus (Mus musculus, Linnaeus, 1758)

Rissiek, Björn

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Freie Schlagwörter (Deutsch): NAD , Tregs , ART2 , P2X7
Freie Schlagwörter (Englisch): NAD , Tregs , ART2 , P2X7 , extracellular
Basisklassifikation: 44.45
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Koch-Nolte, Friedrich (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.04.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 17.07.2012
Kurzfassung auf Deutsch: NAD+ und ATP haben neben ihren intrazellulären Funktionen im Energiestoffwechsel auch extrazelluläre Funktionen als Gefahrensignale bei Entzündungen und Gewebeschädigungen. In Vorarbeiten war der P2X7 Ionenkanal als ein wichtiger Sensor für diese Nukleotide identifiziert worden. Die Aktivierung von P2X7 erfolgt über den löslichen Liganden ATP oder über eine NAD-abhängige Proteinmodifikation: die durch das membranständige Ectoenzym ART2 katalysierte Übertragung der ADP-Ribose-Gruppe von NAD+ auf Arginin 125 von P2X7. Vorarbeiten wiesen ferner darauf hin, dass verschiedenen Subpopulationen von CD4+ T Zellen unterschiedlich stark auf extrazelluläre Nukleotide reagieren.
Ziel dieser Arbeit war die molekulare Charakterisierung der unterschiedlichen Sensitivität von CD4+ Helfer (Thelp) und regulatorischen T Zellen (Tregs) gegenüber extrazellulärem NAD+. Expressionsanalysen zeigten, dass Tregs deutlich mehr P2X7 und etwa gleichviel ART2 exprimieren wie Thelp. Dosis-Wirkungs-Analysen zeigten, dass sowohl Tregs als auch Thelp konzentrationsabhängig auf NAD+ reagieren, die halbmaximale NAD+ Dosis aber bei Tregs ca. 100fach niedriger liegt als bei Thelp. Die fehlende Reaktion von Zellen aus ART2ko und P2X7ko Mäusen bestätigte die zentrale Rolle von ART2 und P2X7 für die NAD-Sensitivität von Tregs. Calciumflux Untersuchen zeigten, dass NAD+ einen stärkeren und schnelleren Influx von Calcium Ionen bei Tregs als bei Thelp auslöst.
Detaillierte Analysen der P2X7-abhängigen Externalisation von Phosphatidylserin und der P2X7-abhängigen Abspaltung von CD27 zeigten, dass bereits bei der Zellpräparation freigesetztes NAD+ die Funktion von Tregs erheblich beeinflusst. Vergleichende Untersuchungen von WT und ko Mäusen zeigten ferner, dass das freigesetzte NAD+ auch die Vitalität und die Suppressorfunktion von WT Tregs nicht aber von ART2ko und P2X7ko Tregs erheblich beeinträchtigt. Tregs aus CD38ko Mäusen hingegen zeigten eine erhöhte Sensitivität, die vermutlich mit der fehlenden NAD-Hydrolyse Aktivität des CD38 zusammen hängt. Die intravenöse Injektion eines ART2-blockierenden Nanobodies bewahrte WT und CD38ko Tregs vor der Beeinträchtigung durch freigesetztes NAD+.
Die hohe Sensitivität der Tregs gegenüber extrazellulärem NAD+ bietet einen potentiellen Ansatzpunkt für die pharmakologische Manipulation dieser Zellen in vivo. Vorarbeiten hatten gezeigt, dass das Ausschalten von Tregs durch Antikörper oder Toxine das Gleichgewicht von Tregs zu Effektor T Zellen (Teff) zugunsten der Teff verschieben und einen positiven Effekt auf die Tumorabwehr haben kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Behandlung von Mäusen mit NAD+ ebenso das Treg/Teff Gleichgewicht zugunsten der Teff verschiebt. Im B16 Tumor Mausmodell ermöglichte dies die Etablierung einer effektiveren anti-Tumor Immunantwort und bewirkte damit ein langsameres Tumorwachstum.
Insgesamt tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zum Verständnis der Rolle von extrazellulärem NAD+ als Gefahrensignal für CD4+ T Zellen bei. Darüber hinaus eröffnen sie die pharmakologische Nutzung von NAD-Injektionen für das Ausschalten von Tregs in vivo sowie von Injektionen ART2-blockierender Nanobodies zum Schutz von Tregs vor der Beeinträchtigung durch freigesetztes NAD+.
Kurzfassung auf Englisch: Next to their intracellular functions in energy metabolism, NAD+ and ATP also serve as extracellular danger signals during inflammation and tissue damage. The P2X7 ion channel has been implicated as an important sensor for these nucleotides. P2X7 is gated upon binding of its soluble ligand, ATP, or by an NAD-dependent post-translational protein modification involving transfer of the ADP-ribose moiety from NAD+ onto Arginine 125, catalysed by the membrane-bound ecto-enzyme ART2. It has been reported that sub-populations of CD4+ T cells react differently to these extracellular nucleotides.
The main goal of this thesis was to molecularily characterize the different sensitivities of CD4+ T helper cells (Thelp) and regulatory T cells (Tregs) to extracellular NAD+. Flow cytometry analyses revealed higher P2X7 cell surface levels on Tregs than Thelp and comparable cell surface ART2 levels on both populations. Dose-response analyses demonstrated that Tregs and Thelp both react to NAD+ in a dose-dependent manner with externalization of phosphatidylserine and shedding of CD27 and CD62L. The half maximal NAD+ dose required to induce these effects on Tregs was approximately 100 fold lower than that for Thelp (0.5 vs. 50 !M). The absence of any reaction to NAD+ by Tregs from ART2ko and P2X7ko mice underlines the central role of the ART2 ectoenzyme and the P2X7 ion channel in mediating NAD+ sensitivity of Tregs. Flow cytometry analyses demonstrated that NAD+ mediated a more rapid and stronger influx of Calcium ions in Tregs than in Thelp. Comparative analyses of cells prepared from WT mice and mice deficient in ART2, P2X7 and CD38, the major ecto-NADase, suggested that NAD+ released during cell preparation sufficed to substantially affect Treg functions. Moreover, comparative analyses of WT and ko mice showed that the released NAD+ impaired cell vitality and the suppressor function of WT Tregs but not of ART2ko or P2X7ko Tregs, whereas Tregs from CD38ko mice showed a higher sensitivity, most likely attributable to the missing NAD-hydrolase activity of CD38. The intravenous injection of ART2-blocking Nanobodies protected WT and CD38ko Tregs from the inhibitory effects of NAD+ released during cell preparation.
The high sensitivity of Tregs towards extracellular NAD+ offers a potential approach for pharmacologically manipulating these cells in vivo. Previous reports using antibodies or toxins to shift the balance of Tregs vs. T effector cells (Teff) in favour of Teff demonstrated that this strategy could be exploited to enhance the anti-tumor response in mouse tumor models. The results shown here demonstrate that sytemic injections of NAD+ into WT and CD38ko mice similarily shift the Treg/Teff balance toward Teff, and results in slower tumor progression in the B16 mouse melanoma model, reflected in a higher ratio of activated tumor-infiltratin effector cells.
The results of this thesis further our understanding of the role of extracellular NAD+ as a danger signal for CD4+ T cells. In addition, they demonstrate the feasibility of new pharmacological approaches to inhibit Tregs in vivo using NAD+ and, conversely, to protect Tregs from the inhibitory effects of NAD+ released during cell preparation using ART2- blocking Nanobodies.

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