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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-57773
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5777/


Regulation der Proliferation und Differenzierung in einem Mammakarzinom-Tumorstammzellsystem durch die Rezeptortyrosinkinase Met

Gruner, Katharina

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SWD-Schlagwörter: Brustkrebs, c-Met Rezeptor, Differenzierung , Plastizität
Freie Schlagwörter (Englisch): breast cancer, c-Met , differentiation, EMT
Basisklassifikation: 42.15
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 27.07.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Brustkrebs ist die am weitesten verbreitete Krebserkrankung innerhalb der weiblichen Weltbevölkerung und die am häufigsten zum Tode führende Krebsart dieser Bevölkerungsgruppe. Die Ursache für die hohe Sterblichkeit der Brustkrebspatientinnen ist jedoch nicht die primäre Läsion, sondern deren Fähigkeit zum invasiven Wachstum, in der das hohe Metastasierungspotential einiger Brustkrebsarten begründet ist. Voraussetzung für ein invasives Wachstum von Tumorzellen ist die Transition der epithelialen Zellen des Primärtumors in bewegliche, in das umliegende Gewebe einwandernde Zellen mit mesenchymalem Phänotyp (EMT). Neueste Studien brachten die Fähigkeit zur Veränderung einer epithelialen Zelle hin zu einem mesenchymalen Differenzierungszustand und zurück (EMT-MET), mit Stammzelleigenschaften, wie z.B. einem hohen Differenzierungspotential und einer erhöhten Lebensdauer sowie der Anreicherung aggressiver, Tumor-initiierender Zellen in Verbindung.
Ein in den letzten zehn Jahren im Fokus der Forschung stehendes Protein, das als Angriffspunkt für neue Therapien der aggressivsten und am schlechtesten therapierbaren Brustkrebsarten dienen könnte, ist die Rezeptortyrosinkinase Met. Eine gesteigerte Met-Expression ist in 15-20% aller humanen Mammakarzinome zu finden und geht immer mit einer schlechten Prognose einher. Die Rezeptortyrosinkinase Met gilt als einer der entscheidenden Induktoren von invasivem Wachstum und EMT und beeinflusst damit die Aggressivität dieser Tumoren grundlegend. Trotz intensiver Studien von Met und dessen zellulärer Signalnetzwerke konnte die Rolle von Met in der Entstehung, Progression und Differenzierung von Mammakarzinomen aufgrund fehlender, die in vivo Situation humaner Mammakarzinome repräsentierender Zellkulturmodelle, bisher nicht ausreichend geklärt werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit analysierten, murinen Mammakarzinomzellen der G-2C9 Kultur spiegeln die phänotypische Heterogenität primärer, in ihrem Aufbau humanen, basalen Mammakarzinomen ähnelnder Tumoren wider und weisen ausgeprägte tumorinitiierende Eigenschaften sowie Eigenschaften von Stamm- bzw. Tumorstammzellen auf. Die Kultur setzt sich aus distinkten, unterschiedlich differenzierten Subpopulationen zusammen, welche in unterschiedlichem Ausmaß in der Lage sind, durch EMT- und MET-Prozesse die Heterogenität der Kultur und somit die Homöostase des Tumorzellsystem aufrecht zu erhalten.
Die Hauptziele der vorliegenden Arbeit lagen darin, den Einfluss der Met-Expression und Aktivität auf die Differenzierung muriner WAP-T Mammakarzinomzellen zu ermitteln, die G-2C9 Zellkultur als Modellsystem für die prä-klinische Analyse Met-abhängiger Signalwege zu etablieren und durch die Identifizierung neuer Met-Downstream-Targets den Met-Signalweg weiter zu entschlüsseln.
In dieser Arbeit konnte die Rolle der Rezeptortyrosinkinase Met an der Aufrechterhaltung des homöostatischen Gleichgewichtes zwischen epithelialen und mesenchymalen Differenzierungszuständen der G-2C9 Zellen gezeigt werden. Hierzu wurde zunächst die Expression und Funktionalität von Met in vitro überprüft, dessen Verteilung in den Subpopulationen der G-2C9 Kultur analysiert sowie der Einfluss von Met auf Proliferation, Differenzierung und Motilität der Zellen mittels Met-Inhibition, Met-Proteinexpressions abhängiger Zellsortierung und shRNA vermitteltem Met-knockdown untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass erstens, Met primär in epithelial differenzierten Zellen exprimiert wird und zweitens, die Inhibition des Met-Signalweges zu einem Verlust des homöostatischen Gleichgewichtes zwischen den Differenzierungszuständen führt. Somit führte die Inhibition von Met zu einer Vereinheitlichung des Differenzierungszustands der Zellen in der G-2C9 Kultur über die Selektion quasi-mesenchymaler Zellen.
Im Zuge der Aktivitätsanalyse des Rezeptors konnte ebenfalls die Expression des Met-Liganden Hgf innerhalb der G-2C9 Zellkultur festgestellt werden. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass zum einen Met und Hgf innerhalb einer Zellkultur exprimiert werden und zum anderen die Expression von Met und Hgf auf verschiedene Differenzierungszustände beschränkt ist.
Parallel führte die Analyse einer Gruppe von in high-grade WAP-T Tumoren mit Met ko-expremierter Gene zur Identifikation des Retinolbindeproteins Rbp7 als neuem Downstream-Target des Met-Signalweges. Es konnte gezeigt werden, dass die Rbp7-Expression von einem intakten Met-Signalweg abhängt. Dieser beeinflusst ebenfalls das Gleichgewicht zwischen den vorliegenden Retinoidbindeproteinen und damit direkt den Retinsäuremetabolismus der Zelle. Hierdurch konnte eine neue Verbindung zwischen dem Met- und Retinsäuresignalweg in G-2C9 Mammakarzinomzellen geknüpft werden, welche die Basis für weitere Analysen liefert.

Kurzfassung auf Englisch: Breast cancer is one of the most widespread diseases in women worldwide, particularly in western countries. Breast cancer is also the most frequent cause of cancer death in the female population. The reason for this high mortality rate is not the primary lesion itself, but the ability of the tumors to grow invasively, which is connected to a high metastatic potential of some subtypes of breast cancer. A prerequisite for invasive growth of tumor cells is the transition of tumor cells from an epithelial to mesenchymal differentiation state (EMT) which endows cells with the ability to invade into the surrounding tissue, disseminate and metastasize. Recent publications connected the ability of cells to undergo a bidirectional transition between epithelial and mesenchymal differentiation states (EMT-MET) to acquisition of stem cell properties featured by a high differentiation potential and longer survival, and thereby correlating EMT-MET processes with the enrichment of highly aggressive, tumor-initiating cells.
In the past years, scientific research has drawn interest in the Met receptor tyrosine kinase as a suitable target for the most aggressive and hence most difficult to treat subtypes of breast cancer. 15-20% of all human breast cancers show an elevated expression of the Met protein, connected with a poor clinical outcome. A large number of clinical studies established a strong relationship between Met-pathway hyperactivation and tumor progression. Met is one of the major inductors of invasive growth and promotes EMT, thus enhancing tumor aggressiveness. In spite of the intensive research on Met and its cellular signaling network, the role of Met in tumor initiation, progression and differentiation is not fully understood. This is due to a lack of suitable in vitro models reflecting the in vivo situation of human basal-like breast cancer.
The WAP-T tumor derived mouse G-2C9 cell culture model analyzed in this study is a highly tumorigenic mammary carcinoma cell line displaying stem-like traits and features of epithelial and mesenchymal differentiation. G-2C9 cells are closely related to primary tumors reflecting their heterogeneity and gene expression profiles. The G-2C9 cell culture comprises cell populations of distinct differentiation states ranging from quasi-epithelial to quasi-mesenchymal phenotypes and constitutes a homeostatic, self-reproducing cancer cell system, maintained by a bidirectional conversion of the cellular subsets.
The aim of this study was (i) to test the applicability of the G-2C9 cell line as a suitable model for pre-clinical research on Met-signaling, (ii) to analyze the influence of Met-expression and activity on the differentiation of mouse G-2C9 mammary carcinoma cells; and (iii) to identify new Met downstream targets to further decipher the Met-signaling pathway in breast cancer cells.
In this study emphasis was on characterization of Met activity as well as on studying the cellular distribution of Met protein expression and on exploring the role of Met in maintaining the homeostatic balance between epithelial and mesenchymal differentiation states. The influence of Met on proliferation, migration and differentiation was investigated in Met inhibitor treated, FACS-sorted Met-positive and Met-negative G-2C9 subpopulations as well as in Met-shRNA expressing cells. It could be shown that the expression of Met is restricted to the subpopulation featured by an epithelial differentiation state, and that inhibiting Met-signaling facilitated the acquisition of a mesenchymal differentiation state. In addition to the differential expression of the Met receptor, the expression of its ligand Hgf could also be detected within the G-2C9 cells. Interestingly, the expression of Hgf was restricted to cells of a quasi-mesenchymal differentiation state, implying a paracrine activation loop between the subpopulations within the cell culture.
Simultaneous analysis of a group of genes, co-expressed with Met in high-grade WAP-T tumors identified the retinol-binding protein Rbp7 as a new downstream-target of the Met-signaling-pathway. Furthermore, Rbp7-expression is dependent on an intact Met-signaling as well as the balance between the expressed retinoid-binding proteins, thus directly affecting the retinoic acid metabolism within the cell. These data highlight a link between the Met- and the retinoic acid pathway in G-2C9 cells, providing a platform for further experimental analysis.

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