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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-57855
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5785/


Untersuchung des Migrationsverhaltens multipotenter mesenchymaler Stromazellen in Selektin-defizienten Mäusen mit Magnetresonanztomographie und Mikroskopie

Salamon, Johannes Martin

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Freie Schlagwörter (Deutsch): MRT , Single-cell imaging , MSZ , Selektine
Freie Schlagwörter (Englisch): Single-cell imaging , MRI , MSC , Selectine
Basisklassifikation: 44.49
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Schumacher, Udo (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.06.2012
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 07.08.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Zielsetzung: Die Zielsetzung dieses Projektes war es, die Bindung von magnetisch markierten multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSZ) an E-/P-Selektinen nachzuweisen und diese Zellen in E-/P-Selektin-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nach intravenöser, ultraschallgesteuerter intracardialer und intraperitonealer Injektion mittels der Magnetresonanztomographie zu verfolgen und die Ergebnisse durch histologische Untersuchungen zu bestätigen.
Material und Methoden: Murine MSZ wurden unter Verwendung von rot fluoreszierenden Eisenoxid-Mikropartikeln (magnetite) und Carboxyfluoresceinsuccinidylester (CFSE) markiert. Der mittlere zelluläre Eisengehalt wurde mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt. Die Expression der Selektinbindungsstellen CD15s und CD162 und die charakteristische Oberflächenmarkerexpression CD44+, CD90+, CD105+, Sca-1+, CD34-, CD45- konnte mittels Durchflusszytometrie vor und nach Markierung verifiziert werden. Das chondrogene Differenzierungspotenzial wurde vor und nach Markierung untersucht. Markierte MSZ wurden in einer Dosis von 1 × 106 Zellen intravenös, 5 × 104 Zellen ultraschallgesteuert intracardial und 5 × 106 Zellen intraperitoneal appliziert. Die Mäuse wurden in einem klinischen 3,0 T MRT-Gerät (Intera, Philips Medical Systems, Best, NL) in-vivo mit einer speziellen Kleintierempfangsspule mit 2D und 3D Gradientenechosequenzen am Tag vor Zellapplikation und bis zu 7 Tage danach sequenziell untersucht. Ex-vivo wurde die Verteilung markierter Zellen und freigesetzter Partikel mittels Konfokal- und Durchlicht-Floureszenzmikroskopie untersucht.
Ergebnisse: Atomabsorptionsspektrometrisch wurde ein mittlerer zellulärer Eisengehalt von 23,6 ± 4,3 pg Fe / Zelle gemessen. Markierte und unmarkierte MSZ zeigten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Expression der genannten Oberflächenmarker, des chondrogenen Differenzierungspotenzials, sowie der Fähigkeit an E-/P-Selektine zu binden. Nach intravenöser Applikation zeigte sich in E-/P-Selektin-defizienten Mäusen ein signifikanter SNR-Abfall allein der Leber von Tag 1 bis Tag 7 nach Applikation, wohingegen sich in den Wildtyp-Mäusen ein zunehmender SNR-Abfall in Leber, Milz und Knochenmark über 7 Tage zeigte. Nach intrakardialer Applikation waren die nach Applikation nachweisbaren multiplen Auslöschungsartefakte durch in den Hirnkapillaren gefangene Zellen in E-/P-Selektin-defizienten Mäusen bis Tag 4 nach Applikation nicht mehr nachweisbar. Im ZNS der Wildtyp-Mäuse konnten einzelne Auslöschungsartefakte bis Tag 7 persistierend gezeigt werden. Nach intraperitonealer Applikation der MSZ in E-/P-Selektin-defiziente Mäuse konnte kein signifikanter Signalabfall in den untersuchten Organen gezeigt werden, wohingegen sich in den Wildtyp-Mäusen ein zunehmender SNR-Abfall, stärker als nach intravenöser Applikation in Leber, Milz und Knochenmark zeigte. Die histologischen, floureszenzmikroskopischen Untersuchungen bestätigten das Vorhandensein von markierten MSZ in Organen mit einem SNR-Abfall.
Schlussfolgerung: Es konnte gezeigt werden, dass MSZ Ihr Differenzierungspotenzial und die Selektinbindungsfähigkeit nach magnetischer Markierung behalten. Die E-/P-Selektindefizienz der Mäuse verändert das Verteilungsverhalten von magnetisch markierten MSZ nach intravenöser und intracardialer Applikation signifikant und führt zu einer Abnahme der transperitonealen Zellmigration nach intraperitonealer Applikation.
Kurzfassung auf Englisch: The aim of this study was to analyze the influence of E- and P-selectins on the migratory pattern of iron-oxide labeled multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) in E-/P-selectin deficient and wildtype mice after intracardiac, intravenous and intraperitoneal administration. Murine MSC were labeled with fluorescent iron-oxide micro-particles and carboxyfluoresceinsuccinidylester (CFSE). Expression of selectin-binding sites CD15s and CD162 as well as MSC markers CD44, CD90, CD105, Sca-1 and lack of CD34 and CD45 were assessed using flow cytometry and immunocytochemistry. Labeled MSC were injected into E-/P-selectin deficient and wildtype mice applying doses of 5 × 104 cells intracardially, 1 × 106 cells intravenously and 5 × 106 cells intraperitoneally. After cell administration mice underwent magnetic resonance imaging repeatedly within 7 days using a clinical 3.0T magnet with a dedicated small animal solenoid coil and high-resolution T2* weighted 3D and 2D coherent gradient-echo (GRE) sequences. Histological evaluation using fluorescence microscopy followed 7 days after cell administration. Labeled and unlabeled MSC revealed similar expression of above mentioned surface markers as well as binding abilities to E-/P-selectins. After intracardiac injection multiple susceptibility artefacts due to initial trapping of MSC in capillaries could be detected in the brain until day 4 in E-/P-selectin deficient mice and up to day 7 in wildtype mice. After intravenous injection of MSC in E-/P-selectin deficient mice a significant SNR decrease was assessed solely in the liver from day 0 to day 1, whereas wildtype mice revealed an increasing SNR decrease of liver, spleen and bone marrow within 7 days. After intraperitoneal injection of MSC in E-/P-selectin deficient mice no significant SNR changes were observed in investigated organs, whereas wildtype mice showed an increasing SNR decrease of liver, spleen and bone marrow within 7 days. Fluorescence microscopy confirmed presence of labeled MSC in organs with SNR decrease. In conclusion, the study could demonstrate that MSC retain their binding ability to E-/P-selectins after iron-oxide labeling and that E-/P-selectin deficiency in mice significantly alters the distribution of iron-oxide labeled MSC after intracardiac, intravenous and intraperitoneal administration.

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