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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-57962
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5796/


Die Rolle der Inositol-5-Phosphatase SHIP1 für das Wachstum von Leukämiezelllinien mit konstitutiv aktivierten Tyrosinkinasen

Precht, Clarissa Viola

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Freie Schlagwörter (Deutsch): SHIP1
Freie Schlagwörter (Englisch): SHIP1
Basisklassifikation: 44.30 , 44.33 , 44.48 , 44.86
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Jücker, Manfred (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.07.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 13.08.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Die Inositol-5-Phosphatase SHIP1 gehört zu den negativen Regulatoren der wachstumsvermittelnden Signalwege in hämatopoetischen Zellen, wie dem Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)/Akt Signalweg. Der Phänotyp der SHIP1- knockout-Maus ist durch eine erhöhte Anzahl von myeloischen Vorläuferzellen in Knochenmark und Milz gekennzeichnet.
In dieser Arbeit wurden sieben Leukämiezelllinien mit konstitutiv aktivierten Tyrosinkinasen auf die Beeinflussbarkeit des Zellwachstums durch eine Überexpression von SHIP1 untersucht. Zuerst wurde überprüft, ob in den ausgewählten Leukämiezelllinien U937, Cole, Eol-1, K562, Kasumi-1, MV4-11 und M1 der PI3K/Akt-Signalweg konstitutiv aktiviert ist, indem mittels Western Blot die phosphorylierte Form von Akt (p-Akt-S473) nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde die Hemmbarkeit der Proliferation durch den PI3-Kinase-Hemmstoff LY 294002 untersucht. In allen 7 untersuchten Zelllinien außer Kasumi-1 konnte p-Akt-S473 nachgewiesen werden und auch die Proliferation aller Zelllinien war durch LY 294002 fast vollständig hemmbar.
Daraufhin wurden die Zelllinien mit dem retroviralen Vektor SF91 mit EGFP, SF91 mit EGFP und SHIP1 oder SF91 mit EGFP und einer enzymatisch inaktiven Form von SHIP1 (D672A) transduziert und sortiert.
In den Zelllinien U937, Cole, Eol-1, K562 und M1 ließ sich SHIP1 überexprimieren. Da auch das grünfluoreszierende Protein EGFP in allen transduzierten Zellen nachgewiesen werden konnte, konnte die Transduktion als erfolgreich angesehen werden. Die Zelllinien wurden nach der Sortierung der EGFP+-positiven Zellen sowohl in 10 % als in 0,5 % FCS-haltigem Nährmedium kultiviert. Hierbei zeigte sich ein Wachstumsnachteil der mit SHIP1 transduzierten Zellen bei den Zelllinien U937, Cole und Eol-1 nur unter serumreduzierten Bedingungen. Für die mit SHIP1 transduzierten U937-Zellen wurden im Vergleich zu der Vektorkontrolle im BrdU- APC-Assay nach 16 Stunden 16,6 % und mit Hilfe einer Wachstumskinetik nach 6 Tagen 70,7 % weniger Zellen gezählt. Bei der Zelllinie Cole belief sich die Wachstumshemmung nach Transduktion mit SHIP1 nach 6 Tagen auf 62.6 %, bei
den EOL-1-Zellen auf 22 %. Im Vergleich zu den Vektorzellen wurde in den mit SHIP1 transduzierten Zellen der Zelllinien U937, Cole und Eol-1 signifikant weniger p-Akt exprimiert. Die Zelllinie M1 wies nach Serumreduktion einen Wachstumsnachteil der SHIP1-Zellen von 7,2 % in 16 Stunden auf. In einem Western Blot zeigte sich eine im Vergleich zu den Vektorzellen erniedrigte p-Akt- Expression um 52 %.
Interessanterweise scheinen die mit der SHIP1-Mutante transduzierten Zellen der Zelllinien Eol-1, Kasumi-1 und M1 im Vergleich zu den Vektorzellen einen kurzfristigen Wachstumsnachteil, gemessen in 16 Stunden mit dem BrdU-APC- Assay, aufzuweisen. Ein negativer Effekt auf die p-Akt-Expression konnte in den in 0,5 % FCS-haltigen Medium kultivierten SHIP1-Mutante-Zellen der Zelllinien U937, Cole und Eol-1 (hier auch in 10 % FCS-haltigem Medium gezeigt) nachgewiesen werden. In den Zelllinien K562 und MV4-11 zeigten sowohl die SHIP1- als auch die SHIP1-Mutante-Zellen eine gesteigerte Proliferation im Vergleich zu den SF91-Zellen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich das Wachstum der Leukämiezelllinien U937, Cole, Eol-1 und M1 in vitro nach Serumreduktion durch die Überexpression der Inositol-5-Phosphatase SHIP1 signifikant hemmen lässt. In weiteren Experimenten muss geklärt werden, ob sich die Proliferation auch in vivo durch SHIP1 reduzieren lässt. Hierzu müsste das Wachstum dieser mit SHIP1 transduzierten Zelllinien in Mäusen untersucht werden.

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