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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-58204
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5820/


Identifikation nukleärer und subnukleärer Lokalisationssignale in der humanen Inositol-1,3,4,5,6-pentakisphosphat 2-Kinase (IP5K)

Kobras, Mario

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Inositol , Lokalisationssignal , Exportsignal , IP5K , Nucleolus
Basisklassifikation: 44.30
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mayr, Georg W. (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 27.08.2012
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 30.08.2012
Kurzfassung auf Deutsch: In der vorliegenden Arbeit wurden die nukleären und subnukleären Zielsteuerungseigenschaften der menschlichen Inositolpentakisphosphat 2-Kinase (IP5K) genauer beschrieben. Dieses Enzym ist nach derzeitigem Kenntnisstand das einzige Protein der menschlichen Zelle, das Inositol-1,3,4,5,6-pentakisphosphat unter ATP-Verbrauch zu Inositolhexakisphosphat (InsP6) umsetzt. Die Wichtigkeit, die IP5K für das Überleben eines Organismus’ darstellt, wird dadurch deutlich, dass IP5K knock-out Mäuse schon embryonal letal sind (Verbsky et al., 2005). In vorangegangenen Arbeiten der Arbeitsgruppe von Prof. Mayr wurde in groß angelegten Untersuchungsreihen die Lokalisation der IP5K in der menschlichen Zelle charakterisiert (Brehm et al., 2007). In der vorliegenden Arbeit wurden die vorliegenden Daten durch verschiedene neue Erkenntnisse ergänzt. Es wurde umfassend nach neuen Leucin reichen Karyopherin abhängigen Signalen gesucht, die den Proteinexport aus dem Kern vermitteln könnten. Von den sechs prädizierten putativen Signalen konnte nur für eines (AS 433-442) eine mögliche Aktivität als nukleäres Exportsignal in HeLa-Zellen
nachgewiesen werden. In diesem Zuge wurde auch untersucht, ob eine Feinregulierung des Kernexportes durch Phosphorylierung stattfindet. So wird IP5K anscheinend vermehrt aus dem Kern exportiert, wenn die Phosphorylierungsstellen S271A und S273A in unphosphoryliertem Zustand vorliegen. Phosphorylierung könnte dies entsprechend hemmen. Die fünf weiteren Leucin reichen Regionen hatten hingegen Einfluss auf die nukleoläre Lokalisation der IP5K. Mutation aller dieser Domänen, sowohl Deletion als auch Substitution der Leucine durch Alanine, führte zu einer stark verminderten Lokalisation in Nukleoli. Kürzlich wurde die 3D-Struktur der AtIP5K veröffentlicht (Gonzalez et al., 2010) und die homologen humanen Aminosäureabschnitte der fünf untersuchten Domänen liegen alle auf
der Oberfläche des Proteins. Aktuelle Studien, die auf der vorliegenden Arbeit beruhen, lieferten bereits Hinweise, dass es sich hierbei um Interaktionsdomänen für nukleoläre Proteine handelt. Diese Motive sind damit für eine nukleoläre Retention der IP5K mitverantwortlich sind. Die nukleären Lokalisationssignale der IP5K (NLS) waren schon vor Beginn der vorliegenden Arbeit ein viel bearbeitetes Thema in der Arbeitsgruppe Mayr,
konnten aber damals noch nicht abschließend charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden auch etliche Ergebnisse aus Projekten vorhergehender Arbeiten weiter experimentell verifiziert, so dass die nukleäre Importfunktion der IP5K nun eindeutig aufgeklärt werden konnte. Die für den Kernimport essentiellen AS sind 152-HEMKHKVCRYC-162 und 172-KWKQISK-179.
Kurzfassung auf Englisch: In this work nuclear and subnuclear targeting features of human inositol pentakisphosphatekinase (IP5K) were described in more detail. Human IP5K is currently the only known enzyme capable of converting inositol-1,3,4,5,6-pentakis-phosphate to inositolhexakisphosphate (InsP6) in human cells. The importance of IP5K for the organism's survival is illustrated by the fact that knock-out mice are embryonic lethal (Verbsky et al., 2005). The intracellular localization of IP5K was intensively investigated by Prof. Mayr's group (Brehm et al., 2007). In this work new aspects were discovered. To characterize the
nuclear export signal of IP5K leucine rich regions were investigated for a potential NES function. One of the six leucine rich sequences (aa. 433-442) shows a possible nuclear export activity in HeLa cells. Also phosphorylation sites for fine regulation were part of the investigation. Nuclear export of IP5K seems to be increased when amino acids S271 and S273 are not phosphorylated. Phosphorylation therefore could prevent nuclear export. All of the other five leucine rich sequences seem to be very important for nucleolar localization of IP5K, since their deletion leads to exclusion of the mutants from nucleoli. In the recently described 3D-structure of IP5K from Arabidopsis thaliana all homologous human domains were located on the external side of the protein (Gonzalez et al., 2010). New studies based on the work at hand indicate that those sites actually interact with nucleolar proteins. Therefore those sequences mediate nucleolar retention of IP5K. Nuclear localization signals of IP5K (NLS) were in the focus of Prof. Mayr’s laboratory before. In former studies NLS activity could not finally be characterized. Here different
formerly performed projects were experimentally verified. The nuclear import signal of IP5K was completely characterized. The essential amino acids are indicated in blue: 152-HEMKHKVCRYC-162 and 172-KWKQISK-179.

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