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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-58483
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5848/


Funktionsgewinn von mutiertem p53 im murinen WAP-T Tumorzellsystem

Lenfert, Eva

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SWD-Schlagwörter: Protein p53 , Brustkrebs , Metastase
Freie Schlagwörter (Deutsch): mutp53 , WAP-T Mausmodell , EMT , Epithelial-mesenchymale Transition
Freie Schlagwörter (Englisch): mutp53 , WAP-T mouse model , EMT , epithelial-mesenchymal transition
Basisklassifikation: 42.13
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Deppert, Wolfgang (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.07.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 21.09.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Mit dem Anstieg der Lebenserwartung und dem Rückgang von Infektionskrankheiten belegen Krebserkrankungen weltweit Rang zwei der Todesursachen. Die Hälfte aller Fälle geht dabei mit der Mutation des Tumorsuppressors p53 einher. Neben dem Verlust der protektiven wtp53-Funktion werden dem mutierten Protein onkogene Funktionen (Gain of function – GoF) in der Tumorgenese zugesprochen, die aber noch nicht im Detail verstanden sind. Deshalb ist die Erforschung der molekularen Mechanismen des Funktionsgewinns von mutiertem p53 (mutp53) für ein besseres Verständnis der Prozesse der Tumorgenese und der Metastasierung von großer Bedeutung. Neue Erkenntnisse über die Wirkung von Schlüsselproteinen der Tumorgenese bergen stets das Potential zur Entwicklung dringend benötigter, innovativer und angepasster Therapien für Krebspatienten.

Im Fokus dieser Arbeit stand die Analyse des GoF zweier p53-Hotspot-Mutationen (R248W, R273H), die häufig in humanen Krebserkrankungen auftreten. Untersucht werden sollte deren maligne Wirkung und mögliche zugrunde¬liegende Mechanismen im WAP-T Mausmodell der Mammakarzinogenese, welches dafür besonders geeignet ist, da das endogene wtp53 durch Komplexbildung mit dem SV40 T-Antigen funktionell inaktiviert ist. Phänotypische Vergleiche zwischen Tumoren monotransgener WAP-T-NP8 und bitransgener WAP-T-NP8xWAP-mutp53 Mäuse (R245W, R270H) zeigten einen aggressiveren Phänotyp der Tumore in den bitransgenen Mäusen. Insbesondere in WAP-T-NP8xWAP-mutp53R245W Tieren war die Malignität deutlich erhöht: Entwicklung von mehr undifferenzierten Tumoren, eine verstärkte Tumorvaskularisierung und eine 3-4-fach höhere Metastasierungsrate in den Lungen. Unter Verwendung von Mikroarray-basierten Genexpressionsanalysen konnte eine mutp53-vermittelte Gensignatur in den Tumoren identifiziert werden, charakterisiert durch Anreicherung EMT- (epithelial-mesenchymale Transition) assoziierter Gene. Der Prozess der EMT wird mit einer vermehrten Metastasierung und einer schlechteren Prognose bei Krebserkrankungen in Zusammenhang gebracht. In den Tumoren der WAP-T-NP8xWAP-mutp53R245W Mäuse wurde sowohl eine erhöhte Expression der Gene von Transkriptions-faktoren wie Snai1 und Zeb1, als auch verschiedener Zelloberflächen¬rezeptoren (Pdgfrα, Pdgfrβ, Fgfr1, Itga5 und Notch4), Wachstums¬faktoren (Tgfβ1 und Pdgfb), Matrix-Metalloproteasen (Mmp3, Mmp10, Mmp11 und Mmp12) und Kollagenen (Col1, Col5, Col6 und Col15) gefunden. Diese sogenannte EMT-Signatur wurde in vitro anhand der aus einem bitransgenen WAP-TxWAP-mutp53 Tumor entwickelten Zelllinie G-2, und der im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls aus einem bitransgenen Tumor generierten H8N8-Linie bestätigt. Beide Zelllinien bilden jeweils ein heterogenes, homöostatisches Tumorzellsystem bestehend aus mesenchymal und epithelial differenzierten Zellen. Weiterhin wurde mit Hilfe dieser in vitro Modelle gezeigt, dass sowohl die ektope mutp53-Expression als auch eine Überexpression einzelner Gene der EMT-Signatur (Zeb1 und Mmp3 exemplarisch in dieser Arbeit) eine verstärkte EMT und somit eine mesenchymale Ausprägung des Zellphänotyps verursachen.
Auf der Suche nach Mechanismen, die für den mutp53-vermittelten GoF verantwortlich sein könnten, wurde basierend auf neueren Literaturdaten zunächst die Interaktion von mutp53 mit p63 untersucht. In den WAP-T Tumoren konnte weder eine mutp53-p63-Interaktion noch eine Regulation von p63-kontrollierten Zielgenen (hier miR-200 Familie) nachgewiesen werden. Interessanterweise wurde eine vermehrt zytoplasmatische Lokalisation des mutp53R245W-Proteins in den Tumorzellen festgestellt. Funktionen von zytoplasmatischem mutp53 sind bisher nahezu unbekannt. Erste Anhaltspunkte könnte die Beobachtung liefern, dass WAP-T Zellen, die mutp53 überexprimieren, eine ebenso ausgeprägte Lokalisation des Glucocorticoidrezeptors (GR) im Zytoplasma aufweisen. Zusammen mit Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe weisen diese Ergebnisse auf eine Interaktion von mutp53 mit dem GR hin. Da der GR in eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen (wie z.B. PI3K/Akt , MAPK- oder Tgfβ- Signalwege) involviert ist, stellt die Wechselwirkung mit mut53 möglicherweise einen neuen regulatorischen Mechanismus für den GoF von mutp53 dar.

Zusammenfassend bestätigen die hier gewonnenen Daten einen mutp53-vermittelten GoF hinsichtlich der Malignität in der Mammakarzinogenese im WAP-T Mausmodell. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit des WAP-T Mausmodells mit humanen Mammakarzinomen können die hier erzielten Erkenntnisse auf die humane Situation übertragen werden. So kann die epithelial-mesenchymale Transition ebenso bei Brustkrebspatientinnen die Metastasierung begünstigen. Die Erforschung der Rolle einzelner EMT-assoziierter Proteine und deren Modulation könnte in Zukunft Grundlage neuer therapeutischer Strategien sein.
Kurzfassung auf Englisch: Due to rising life expectancy and a decline in infectious diseases, cancer is the second leading cause of death in the world. In about 50% of all cases, cancers contain mutations in the Tp53 gene, a tumor suppressor gene. In addition to the loss of wtp53 protective functions, mutant p53 (mutp53) acquires novel oncogenic functions (gain of function – GoF) during tumorigenesis, which are so far not yet completely understood. In order to understand the role of mutp53 in mammary carcinogenesis and in the process of metastasis, its molecular mechanisms of action need to be determined in detail. New findings on the role of key proteins in these processes have the potential to promote the development of urgently needed innovative and customized therapies for cancer patients.

The goal of this thesis was to examine the GoF of two p53 hot spot mutations (R248W, R273H), that frequently occur in human cancer. To study their role in the malignancy of the disease and the possible underlying mechanisms, the SV40 transgenic WAP-T mouse model for mammary carcinogenesis was used. This model is especially suitable for this task, because the endogenous wtp53 is functionally inactivated by complex formation with SV40 T-Ag. The tumor phenotypes of monotransgenic WAP-T-NP8 and bitransgenic WAP-T-NP8xWAP-mutp53 (R245W, R270H) mouse lines were compared and indicated a more aggressive phenotype in bitransgenic mice. In particular, tumors in WAP-T-NP8xWAP-mutp53R245W mice showed a significantly increased malignancy, characterized by the development of more undifferentiated tumors, increased tumor vascularization and a 3-4-fold higher rate of metastasis in lungs. Using microarray-based gene expression analysis a mutp53-mediated gene signature, enriched in EMT (epithelial-mesenchymal transition) associated genes, could be identified in tumors of bitransgenic mice. The process of EMT is associated with an increased metastasis rate and a poor prognosis for patients. Multiple genes were identified to be differently regulated in tumors of WAP-T-NP8xWAP-mutp53R245W mice e.g. increased expression encoding transcription factors such as Snai1 and Zeb1, various cell surface receptors (Pdgfrα, Pdgfrβ, Fgfr1, Itga5 and Notch4), growth factors (Tgfβ1 and Pdgfb), matrix metalloproteases (Mmp3, Mmp10, Mmp11 and Mmp12) and several collagens (Col1, Col5, Col6 and Col15). The EMT signature was confirmed in vitro using G 2 cells derived from a bitransgenic WAP-TxWAP-mutp53 tumor and H8N8 cells, a newly established cell line that originated from another bitransgenic tumor. Both cell lines form a heterogeneous homeostatic tumor cell system consisting of an epithelial and a mesenchymal cell population. Experiments in the in vitro models showed that ectopic mutp53 expression as well as an overexpression of individual EMT signature genes (focus was on Zeb1 and Mmp3) increased EMT and led to the development of a mesenchymal cell phenotype. In order to determine possible mechanisms for mutp53-mediated GoF, the already described interaction of mutp53 with p63 was examined. Neither an interaction of mutp53 with p63, nor the regulation of p63-controlled target genes (e.g. the miR-200 family) could be detected. Interestingly, an accumulation of mutp53R245W protein in the cytoplasm of tumor cells could be observed. However, possible cytoplasmic functions of mutp53 remain still unclear. A first hint toward such a function, a mutp53-dependent accumulation of the glucocorticoid receptor (GR) in the cytoplasm was detected. These observations support earlier findings from our group that suggest an interaction of mutp53 with the GR. Since the GR is involved in a variety of signaling pathways (such as PI3K/Akt-, MAPK or Tgfβ-signaling pathways), an interaction with mutp53 might present a new potential regulatory mechanism for mutp53-mediated GoF.

In conclusion, the obtained data confirm a mutp53-mediated GoF regarding the malignancy of mammary carcinogenesis in the WAP-T mouse model. Due to the high resemblance of WAP-T mouse tumors to certain human breast cancers, the results from this thesis can be transferred into a human context, indicating that the process of epithelial-mesenchymal transition may also promote metastasis in breast cancer patients. The analysis of individual EMT associated proteins and their regulation promises to be important for new therapeutic strategies.

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