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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-58587
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5858/


Nitrospira, Schlüsselorganismus der Nitritoxidation in gemäßigten und extremen Lebensräumen

Off, Sandra

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SWD-Schlagwörter: Aquakultur , Nitrifikation , Nitrospira
Freie Schlagwörter (Deutsch): Kultivierung , Nitritoxidoreduktase
Freie Schlagwörter (Englisch): Nitrospira , nitrification , aquaculture , cultivation , nitrite oxidation
Basisklassifikation: 42.30
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Spieck, Eva (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.06.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 16.10.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Nitrit-oxidierende Bakterien der Gattung Nitrospira sind für den zweiten Schritt der Nitrifikation verantwortlich. Sie weisen charakteristisch eine hohe Flexibilität und Diversität auf, die im Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht wurde. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen wurden 24 neue Anreicherungen aus den unterschiedlichsten Lebensräumen wie Permafrost beeinflussten Böden, Wüstenböden, geothermalen Quellen und Süßwasser-Aquakulturen gewonnen und phylogenetisch eingeordnet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zuordnung der 16S rRNA Gensequenzen der Anreicherungskulturen innerhalb der Untergruppen nicht habitatspezifisch ist. Ausnahmen bilden einzig der marine Cluster IV und der moderat thermophile Cluster VI. Für Untersuchungen der Verwandtschaftsverhältnisse anhand eines funktionellen Gens ist das der Beta-Untereinheit der Nitritoxidoreduktase (NxrB) nur eingeschränkt verwendbar, da die Phylogenie der Stammbäume basierend auf der 16S rRNA und der NxrB heterogen ist. Anhand der Aminosäuresequenz der NxrB können jedoch Hinweise auf markante physiologische Eigenschaften wie die Anpassung an trockene Habitate gewonnen werden.
In Kooperation mit der russischen Kollegin Dr. Elena Lebedeva ist es gelungen, eine neue Art (Nitrospira calida), die aus geothermalen Quellen stammt, zu isolieren und zu beschreiben. Des Weiteren wurde ein Vertreter von Nitrospira aus dem Mesohyl des marinen Schwammes Aplysina aerophoba im Labor kultiviert und charakterisiert. Physiologische Vergleiche von Nitrospira-Kulturen haben gezeigt, dass diese Nitritoxidanten eine hohe Anpassung an niedrige Sauerstoff- und Substratkonzentrationen aufweisen. Hinsichtlich des Einflusses des pH-Wertes auf das Wachstum von Nitrospira konnte festgestellt werden, dass diese Bakterien empfindlich gegenüber sauren pH-Werten reagieren und unterhalb eines pH-Wertes von 6 in einer Mischkultur von Nitrobacter verdrängt wurden. Zusätzliche Untersuchungen zur ökologischen Nischenbildung haben ergeben, dass die Temperatur einen wesentlichen Einfluss auf die Zusammensetzung der Nitrit-oxidierenden Gemeinschaft im Belebtschlamm hat. Während Candidatus Nitrotoga bei niedrigen Temperaturen bis 22 °C aktiv ist, zeigt Nitrospira ein breites Temperaturspektrum von 10 - 32 °C. Nitrobacter lässt sich dagegen vorzugsweise ab 17 °C anreichern. Diese Differenzierung ermöglicht eine Koexistenz aller drei Gattungen im selben Lebensraum mit jahreszeitlich schwankenden Temperaturen. Auch in einer Süßwasser-Aquakulturanlage tritt diese Koexistenz der genannten drei Gattungen auf. Weiterführende Untersuchungen haben gezeigt, dass ein leicht saurer pH-Wert von 6,8 und ein erhöhter Mangangehalt im Wasserkreislauf der Anlage geringe Selektionsvorteile für Candidatus Nitrotoga gegenüber Nitrospira darstellen.
Die im Genom codierte Resistenz gegenüber Acriflavin wurde erfolgreich eingesetzt, um die letzten Begleitorganismen zu hemmen und eine Reinkultur von Nitrospira defluvii zu erhalten. Mit dieser konnten physiologische Untersuchungen zum mixotrophen Wachstum durchgeführt werden. Dabei zeigte sich, dass N. defluvii durch Zugabe von Pyruvat schneller wachsen kann als im rein mineralischen Medium. Weiterhin wurde eine Zunahme an extrapolymeren Substanzen festgestellt, wenn Zellen von N. defluvii Stressfaktoren wie einer hohen Nitritkonzentration (30 mM) oder dem Antiseptikum Acriflavin ausgesetzt wurden. Aus der Reinkultur von N. defluvii und zusätzlich von Nitrospira moscoviensis konnte der Enzymkomplex der Nitritoxidoreduktase (Nxr) erfolgreich isoliert werden. Ein rein mechanischer Zellaufschluss resultierte in einer intakten und aktiven Nxr, die mittels Zentrifugation und anschließender FPLC (fast performance liquid chromatography) von gröberen Membranfragmenten und anderen Proteinen getrennt werden konnte. Bemerkenswert war dabei die Anreicherung der spezifischen Aktivität der Nxr-Fraktionen bis zu 23-fach im Vergleich zu den Rohextrakten. Zusätzlich zu den bekannten Alpha- und Beta-Untereinheiten der Nxr wurde in der aktiven Fraktion die putative Gamma-Untereinheit mit einem relativen Molekulargewicht von 34 kDa identifiziert. Sie codiert für eine transmembrane Domäne, die als Membrananker der Nxr dienen könnte.
Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Aussage, dass Nitrospira in vielen moderaten und extremen Lebensräumen der Schlüsselorganismus der Nitritoxidation ist. Die größere Anzahl an Referenzorganismen und die neu erlangten Erkenntnisse über die Physiologie und Biochemie von Nitrospira ermöglichen weiterführende Experimente, um die Wissenslücke zu Nitrobacter zu schließen.
Kurzfassung auf Englisch: The genus Nitrospira belongs to the nitrite-oxidizing bacteria, which are responsible for the second step of nitrification. In this work their characteristic high level of flexibility and diversity has been studied in culture. By optimizing the culture conditions, 24 new enrichments from different habitats such as permafrost affected soils, desert soils, geothermal springs and freshwater aquacultures were obtained and classified phylogenetically. It could be shown that the assignment of the 16S rRNA gene sequences of the enrichment cultures within the subgroups is not habitat specific with the exceptions of the marine cluster IV and the moderately thermophilic cluster VI. For studies of the relationships on basis of a functional gene, the beta-subunit of the nitrite oxidoreductase (NxrB) is only partially applicable, since the phylogeny of the trees based on 16S rRNA- and the NxrB-sequences is heterogeneous. However, based on the amino acid sequence of NxrB, indications for physiological properties such as adaptations to arid habitats were obtained.
In cooperation with the Russian colleague Dr. Elena Lebedeva from the Winogradsky Institute of Microbiology in Moscow, a new species (Nitrospira calida), which originates from a geothermal spring, was successfully isolated and described. Furthermore, a representative of Nitrospira from the mesohyl of the marine sponge Aplysina aerophoba was cultivated in the laboratory and characterized. Physiological studies of Nitrospira-cultures have shown that these nitrite-oxidizing bacteria possess a high adaptation to low oxygen and substrate concentrations. Regarding the influence of pH on the growth of Nitrospira, it was found that these bacteria are sensitive to acidic pH values. In a mixed culture with Nitrobacter bacteria of the genus Nitrospira were replaced below a pH value of 6. Additional studies on the ecological niche formation have shown that the temperature has a significant influence on the composition of the nitrite-oxidizing community in activated sludge. While the cold adapted Candidatus Nitrotoga is active at low temperatures up to 22 °C, Nitrospira shows a wide temperature range of 10 - 32 °C for growth. However, Nitrobacter can be enriched preferably above 17 °C. The different temperature profiles explain that several nitrite-oxidizing bacteria can survive in distinct ecological niches. a coexistence of the three genera (Nitrospira, Nitrobacter and Candidatus Nitrotoga) was also found in a freshwater aquaculture. Further studies have shown that a slightly acidic pH of 6.8 and increased manganese content in the water cycle of the aquaculture represent selective advantages for Candidatus Nitrotoga compared to Nitrospira.
The genome encoded resistance against acriflavine was used successfully to inhibit the last accompanying heterotrophic organisms and to obtain a pure culture of Nitrospira defluvii. This culture was used for physiological studies about mixotrophic growth. It was found that N. defluvii can grow faster by the addition of pyruvate than in purely mineral medium. An increase in extra-polymeric substances was noted, when cells of N. defluvii were exposed to stress factors such as high nitrite concentration (30 mM) or the antiseptic acriflavine. In biochemical experiments, the Nxr of N. defluvii and Nitrospira moscoviensis could be successfully isolated. A purely mechanical cell disruption resulted in an intact and active Nxr, which could be separated from large membrane fragments and other proteins. Noteworthy was the accumulation of the specific activity of the Nxr fractions up to 23-fold compared to the crude extracts. In addition to the known alpha- and beta-subunits of the Nxr in the active fraction, the putative gamma subunit with a relative molecular weight of 34 kDa was identified. It encodes for a transmembrane domain that could serve as a membrane anchor of the Nxr.
The results of this study support the statement that Nitrospira is the key organisms of nitrite oxidation in many moderate and extreme habitats. The larger number of reference organisms and the newly acquired knowledge about the physiology and biochemistry of Nitrospira allows further experiments to close the knowledge gap to Nitrobacter.

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