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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-58681
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5868/


Einfluss von Inhibitoren der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur auf die Zytostatika-Sensitivität von Tumorzellen

Roth, Linda

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SWD-Schlagwörter: DNS-Reparatur , Doxorubicin , Etoposid
Freie Schlagwörter (Deutsch): Topoisomerase II alpha, NHEJ , Homologe Rekombination, Zytostatikasensitivität
Basisklassifikation: 44.40
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dartsch, Dorothee (JProf. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 17.10.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Diese Arbeit handelt von der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen. Im Besonderen soll der Einfluss von Inhibitoren der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur auf die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber
Topoisomerase IIα-Inhibitoren untersucht werden. Als Vertreter dieser Gruppe wurden die Zytostatika Etoposid und Doxorubicin eingesetzt. Die Experimente wurden in der AML-Zelllinie THP-1 und der Kolonkarzinomzelllinie CACO-2 durchgeführt.
Unter den gewählten Bedingungen konnten durch Etoposid induzierte DNA-Strangbrüche fast immer schnell entfernt werden, wohingegen nach Behandlung mit Doxorubicin entstandene DNA-Strangbrüche wegen dessen Interkalation in die DNA bestehen blieben. Die Korrelation des Reparaturgeschehens mit den zytotoxischen Effekten fiel dabei unterschiedlich aus. Während die Reparatur nach der Behandlung mit 5 µM Etoposid in den CACO-2-Zellen mit einem fast unverändert hohen Anteil vitaler Zellen einherging, stieg unter den gleichen Bedingungen der Anteil toter THP-1-Zellen. Die Persistenz der durch Doxorubicin induzierten DNA-Strangbrüche korrelierte mit einer Reduktion der Viabilität, wobei die THP-1-Zellen stärker reagierten. Als bestimmende Parameter für die zytotoxische Wirkung von DNA-Strangbrüchen werden die Komplexität des Strangbruchs, das Verhältnis von Doppelstrangbrüchen zu Einzelstrangbrüchen und deren Lokalisation angenommen.
Im Falle der Inkubation mit Etoposid kann bei den CACO-2-Zellen von einer resistenzvermittelnden Wirkung der DNA-Reparatur gesprochen werden. Es fand eine schnelle Ligation der Strangbrüche statt, ohne dass es unter den gewählten Bedingungen zu weiteren relevanten Veränderungen kam. Aufgrund der schnellen Kinetik der Reparatur wird auf NHEJ als Hauptweg geschlossen.
Die Zunahme toter Zellen in den THP-1-Zellen nach der Behandlung mit Etoposid zeigt, dass die DNA-Reparatur hier keine resistenzvermittelnde Wirkung hatte. Der Anstieg sowohl der DNA-PKcs-Levels als auch der Expression von Rad54 spricht dafür, dass die Doppelstrangbrüche durch das NHEJ alleine nicht korrekt behoben werden konnten. Ein Modell für diesen Fall ist die rasche, aber ungenaue, Ligation der DNA-Enden mit einem sich anschließenden Versuch der Überarbeitung durch Proteine der HR. Da der Zelltod allerdings sehr rasch eintrat, konnte dieser langsamere Reparaturweg nicht mehr erfolgreich arbeiten. Zudem war der Anteil der Zellen in der G2/M-Phase im Vergleich zu den CACO-2-Zellen geringer, so dass nicht genügend geeignete Templates für die HR zur Verfügung standen.

Während die CACO-2-Zellen nach Doxorubicin Behandlung in der G2/M Phase akkumulierten, schritten die THP-1-Zellen weiter voran. Der im Vergleich zu den CACO-2-Zellen stärker erniedrigte CHK1-Gehalt verhinderte einen G2/M-Arrest. Gleichzeitig führte er zu reduzierten Rad51-Levels und stand somit einer Bearbeitung der DNA-Enden durch die HR entgegen. Die Zellen starben. Grundsätzlich kann ein solcher Arrest der Zelle Zeit zur Reparatur geben. Wenn niedrige CHK1-Levels mit einer verminderten Fähigkeit zur Reparatur und einer Unterdrückung von Kontrollpunkten einhergehen, so sollte eine Hemmung von CHK1 die Wirkung von Topoisomerase IIα-Inhibitoren verstärken können. Aus diesem Grund wurden Untersuchungen mit einem CHK1-Inhibitor durchgeführt.
Um den Beitrag weiterer Proteine zur DNA-Doppelstrangbruch Reparatur zu beurteilen, wurden Versuche mit einem DNA-PKcs-, einem ATM- und einem Ligase-Inhibitor durchgeführt. Dabei wurde ausschließlich mit den
THP-1-Zellen nach Etoposid- Inkubation gearbeitet.
Relevante Einflüsse auf den Reparaturverlauf ergaben sich aus den Versuchen mit dem CHK1-Inhibitor und dem DNA PKcs-Inhibitor.
Durch die CHK1-Hemmung blieb das Niveau der DNA-Strangbrüche bis zum Ende erhöht. Da reduzierte CHK1-Levels zu einer Abschwächung der HR führen können, stellt dies ein Indiz dafür da, dass die HR an der Reparatur beteiligt ist. Auch die zytotoxische Wirkung von Etoposid wurde verstärkt. Dieses Ergebnis spricht für CHK1 als therapeutisches Target zur Verbesserung der Etoposid Wirkung.
Die Inhibition der DNA-PKcs konnte die Reparatur verlangsamen. Die Toxizität von Etoposid wurde dabei verstärkt. Dies bestätigt den Beitrag der DNA-PKcs am Reparaturgeschehen.

Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Einfluss der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen auf die Sensitivität von Topoisomerase IIα-Inhibitoren von der verwendeten Zelllinie abhängt. Die Zusammenhänge zwischen gesteigerter Proteinexpression, Zellzyklusarrest, Reparatur und Zytotoxizität fielen dabei sehr unterschiedlich aus. Außerdem konnte die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Etoposid durch gezielte Hemmung von Proteinen der Schadensantwort gesteigert werden.
Kurzfassung auf Englisch: This thesis investigates the influence of inhibitors of DNA double-strand break repair on the sensitivity of tumour cells to topoisomerase IIα inhibitors. The anticancer agents etoposide and doxorubicin where used as representatives of this drug type. The experiments were carried out in THP-1 cells (AML cell line) and in CACO-2 cells (colon carcinoma cell line).
The results showed that DNA strand breaks induced by etoposide were rapidly removed, whereas DNA strand breaks produced by doxorubicin persisted, presumably due to its DNA intercalation. There was no universal correlation between DNA repair after etoposide treatment and cell survival. CACO-2 showed no increase of dead cells. In contrast, analysis of THP-1 cells revealed a decrease in living cells. The persistence of strand breaks induced by doxorubicin correlated with cytotoxicity.
Possible determinants of cytotoxicity of DNA strand breaks are the complexity of strand breaks, the ratio of single to double strand breaks and the localisation of break sites.
Etoposide resistance in CACO-2 cells seemed to be a consequence of DNA repair. DNA ends were rapidly re-ligated without any other relevant response, e.g. cell cycle arrest or protein expression. It can be concluded from the fast repair kinetics that most of the strand breaks were successfully repaired by NHEJ (non-homologous end joining).
As there was an increase in dead THP-1 cells after etoposide treatment, resistance could obviously not be achieved by strand re-ligation in this case. Rising Rad54 levels in addition to increased DNA-PKcs levels indicated that NHEJ could not cope with the induced double strand breaks alone. This can be described by the following model: NHEJ rejoined the two DNA ends in a fast but error-prone way. Therefore, homologous recombination proteins were applied to rework the ligation. As cell death occurred very soon, HR (homologous recombination) proteins could not complete their task. In addition, the percentage of cells in G2/M-stage was lower than in CACO-2 cells which indicates a lack of adequate templates for repair through HR.

Doxorubicin caused CACO-2 cells, but not THP-1 cells to accumulate at G2/M. This difference might result from the more pronounced decrease of CHK1 protein levels in THP-1 cells. Low CHK1 levels work against a cell cycle arrest. Further, reduced CHK1 protein levels led to a decrease in Rad51 levels thereby hindering HR. The cells died. Basically, a cell cycle arrest may allow for repair. If low CHK1 levels are associated with suppressed checkpoints and a reduced repair capacity the effects of topoisomerase IIα inhibitors will be increased through inhibition of CHK1. For this reason, experiments were conducted with a CHK1 inhibitor.
In order to assess the contribution of further proteins to DNA double-strand break repair experiments were carried out with inhibitors of DNA-PKcs, ATM, and Ligase. These assays were performed on THP-1 cells after etoposide treatment. The CHK1 inhibitor and the DNA-PKcs inhibitor were able to influence the repair course. The inhibition of CHK1 led to elevated levels of strand breaks until the end of the experiment. As reduced CHK1 levels are able to attenuate repair through HR, this result implies that HR was part of the answer towards etoposide induced double-strand breaks. Moreover, the cytotoxic effect of etoposide was potentiated by the CHK1 inhibitor. Altogether, these observations indicate that CHK1 could be a target in combination therapy with etoposide.

The DNA-PKcs-inhibitor reduced the repair rate. The toxicity of etoposide increased. These results underline the importance of DNA-PKcs in DNA double-strand break repair.

This study could demonstrate that the influence of DNA double-strand break repair on the sensitivity to topoisomerase II α inhibitors is cell type-dependent. Correlations between changes in protein expression, cell cycle shifts, repair and cytotoxicity were cell type and drug-dependend.

The specific inhibition of damage response proteins could improve the sensitivity of tumour cells to Etoposide.

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