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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-58738
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5873/


Detektion und molekulare Charakterisierung von zirkulierendenTumorzellen aus dem peripheren Blut von Patienten mit kolorektalem Karzinom

Gasch, Christin

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SWD-Schlagwörter: Darmkrebs , Tumorzelle , Einzelzellanalyse , Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor , Metastase
Basisklassifikation: 44.81 , 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pantel, Klaus (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 21.09.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 18.10.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Trotz der zumeist vollständigen chirurgischen Resektion des Primärtumors gehört das kolorektale Karzinom mit jährlich 30000 Todesfällen zu den häufigsten Todesursachen in Deutschland. Die hohe Mortalitätsrate ist durch das Auftreten eines Tumorrezidivs sowie durch die Ausbildung von Fernmetastasen z.B. in der Leber und Lunge bedingt. Den Ausgangspunkt für das erneute Auftreten der Krebserkrankung bilden sogenannte disseminierte Tumorzellen, welche sich vom Primärtumor lösen und über das lymphatische oder Blutsystem (zirkulierende Tumorzellen; CTCs) in distante Organe gelangen und dort für die Formation von Metastasen verantwortlich sind.
Die molekulare Analyse von zirkulierenden Tumorzellen aus dem Blut von Krebspatienten könnte nicht nur einen Betrag zum besseren Verständnis des Metastasierungsprozesses liefern, sondern auch zu einer Identifikation neuer Ziele zur Behandlung von Krebserkrankungen beitragen. Des Weiteren könnte die Analyse von CTCs auf Einzelzellebene Vorteile gegenüber der derzeit gängigen Primärtumoranalyse im Hinblick auf therapierelevante Marker bieten. Aufgrund der intratumoralen Heterogenität und unterschiedlicher molekularer Ereignisse zwischen Primärtumor und Metastasen ist die Frage, inwieweit Analysen kleiner Biopsien die molekulare Beschaffenheit des Primärtumors und der Erkrankung insgesamt repräsentieren können, bisher nicht eindeutig geklärt. Des Weiteren gibt die Primärtumor-Analyse lediglich Auskunft über den Zustand zum Zeitpunkt der Biopsieentnahme. Die Analyse spezifischer molekularer Marker in CTCs von Krebspatienten hingegen könnte als “flüssige Biopsie” Verwendung finden, die einfach und wiederholbar durchzuführen ist, die Erkrankung zum Zeitpunkt der Blutabnahme widerspiegelt und folglich die Entwicklung einer individualisierten Krebstherapie ermöglichen könnte.
Zur Detektion von CTCs aus dem peripheren Blut von insgesamt 123 Darmkrebspatienten wurde das CellSearch-System, welches bereits von der FDA zur Überwachung des Krankheitsverlaufes bei metastasierten Brust- Darm- und Prostatapatienten zugelassen wurde, eingesetzt. Die Detektion von mindestens einer CTC in 7.5 mL konnte mit dem Vorhandensein von Lymphknoten- und/oder Fernmetastasen, der Nachweis von mindestens 3 CTCs zusätzlich mit der Ausdehnung des Primärtumors korreliert und folglich die prognostische Relevanz von CellSearch-detektierten CTCs im peripheren Blut von Kolorektalkarzinompatienten bestätigt werden.
Für weiterführende molekulare Analysen der detektierten CTCs wurden unter Verwendung von Tumorzelllinien zunächst für verschiedene Folgeapplikationen (CGH, qPCR, Sequenzierung) geeignete Protokolle zur Amplifikation des Gesamtgenoms (WGA) von Einzelzellen etabliert. Mit Hilfe dieser Protokolle konnten in dieser Arbeit erstmalig Untersuchungen der genomischen DNA von CellSearch-detektierten CTCs auf Einzelzellebene durchgeführt werden. Die Genotypisierung der DNAs von insgesamt 151 einzelnen CTCs aus 13 Kolorektalkarzinompatienten zeigte eine deutliche Heterogenität der einzelnen CTCs eines Patienten bezüglich chromosomaler Aberrationen, Genamplifikationen (EGFR, AURKA, C-MYC, LGR5) und -mutationen (P53, KRAS, BRAF, PIK3CA). Diese Koexistenz verschiedener Genotypen innerhalb einer CTC-Population steht im Einklang mit der für kolorektale Primärtumoren beschriebenen genomischen Heterogenität.
Die im ersten Teil dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse bilden den Ausgangspunkt für weiterführende Analysen von einzelnen CTCs aus Patienten mit verschiedenen Tumorerkrankungen, welche zukünftig als Hilfsmittel für Therapieentscheidungen dienen sowie zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele beitragen könnten.

In einem zweiten Teil dieser Arbeit erfolgte die Etablierung eines Zytotoxizität-Assays für CTCs mit Hilfe der EPISPOT-Technik. Während eine Unterscheidung von lebensfähigen und apoptotischen CTCs mit den meisten CTC-Detektionsmethoden, wie z.B. dem CellSearch-System nicht eindeutig möglich ist, bietet der EPISPOT-Assay den Vorteil, dass hierdurch ausschließlich intakte, sekretorisch aktive Tumorzellen detektiert werden. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung eines Assays zur Untersuchung der Wirksamkeit von Zytostatika auf lebensfähige Tumorzellen genutzt. Zu diesem Zweck wurden die kolorektale Zelllinie HT29 und ein selektierter, gegenüber dem Zytostatikum Oxaliplatin resistenter HT29-Subklon eingesetzt. Insgesamt konnte im Zelllinienmodell eine Abnahme von sekretorisch aktiven bzw. intakten Tumorzellen durch die Zugabe von Zytostatika mit Hilfe der EPISPOT-Technik nachgewiesen werden. Der entwickelte Zytotoxizitäts-Assay könnte zukünftig zu einer genaueren Abschätzung des Erfolges verschiedener Therapiemaßnahmen beitragen.

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