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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-59362
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5936/


Etablierung und Optimierung der statischen in vitro Hepatozytenkultur auf biodegradierbaren 3D PLLA Polymeren im 96–Well Format für Toxikologiestudien

Deichmann, Steffen

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SWD-Schlagwörter: Tissue Engineering , In-vitro-Kultur , Polymere , Toxikologische Bewertung , Pharmakologie
Freie Schlagwörter (Deutsch): Hepatozyten Kultur
Basisklassifikation: 44.65
Institut: Medizin
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Pollok, Jörg (PD Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 05.12.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Einleitung: Hepatozytenkulturen mittels Tissue Engineering auf Polymergerüsten sind neben ihrer Verwendung in der Transplantationsmedizin auch als in vitro Testsysteme für Arzneimittelentwicklung für ADMET Studien interessant. Tierexperimentelle Forschung und klinische Studien an humanen Probanden sind notwendig, gelten jedoch als teuer und ethisch umstritten. Daher sind in vitro Zellkultursysteme für ADMET Studien als wichtige Alternative zu nennen. Sie zeichnen sich durch Kosteneffizienz weniger Kontroversität und leichterer Durchführbarkeit sowie besserer Reproduktion aus. Aufgrund des ökonomischen Drucks ist die Industrie auf robuste und effektive Testsysteme mit der Möglichkeit eines hohen Durchsatzes angewiesen. Hier sind vor allem 96-Well Systeme als zukunftsträchtig zu nennen. Die Anwendung dieser Kulturen ist in der pharmazeutischen Forschung momentan allerdings noch nicht ausreichend etabliert.

Methoden: Wir nutzten ein modifiziertes synthetisches PLLA Polymer welches eine hohe Porosität mit Vernetzung zwischen den Poren für bessere Zell-Adhäsion, Migration, Genexpression, Nährstofftransport und Differenzierung bieten sollte. Zunächst wurden aufgrund der neuen Polymerstrukturen Charakterisierungsversuche im 24-Well Format nötig. Nach weiteren Polymer- und Besiedlungsmodifizierungen sowie Etablierungen von Überstandsmessungen, Histologiegewinung, DNA und RNA Isolation erfolgte die Durchführung der statischen in vitro Hepatozytenkultur im 96-Well Format.

Ergebnis: Im 24-Well Format konnte die 3D in vitro Hepatozytenkultur erfolgreich etabliert werden. In Vorversuchen zeigte sich zunächst eine geringe Besiedlungseffizienz mit hydrophober Polymereigenschaft. Durch die Zentrifugationsbesiedlung und einem zusätzlichen Schritt zur Hydrophilierung des Polymers konnten vollere Polymerstrukturen mit vitalen Hepatozyten in der Histologie erreicht werden. In den Überstandsmessungen konnte über die gesamte Zellkulturdauer Albumin gemessen werden. Zudem wurde in der Etablierungsphase deutlich, dass Vitalitätsmessungen am Überstand durch den WST-1 Umsatztest nicht für unsere Polymerstrukturen geeignet waren. Im 96-Well Format konnte erfolgreich die statische in vitro Hepatozytenkultur durchgeführt werden. Überstandsmessungen sind möglich und zeigten die höchsten Albuminkonzentartionen auch im Vergleich zur 24-Well Kultur. Es konnten mittels DNA Messung Rückschlüsse auf die Zellzahlen gezogen werden. Zudem konnte ausreichend RNA isoliert werden, um eine reverse Transkription in cDNA durchzuführen. Mittels rtPCR sind spezifische Genanalysen (z.b. Cytochrome P450) in der 96-Well Kultur möglich. In der Immunfluoreszenz konnten am letzten Kulturtag positve Antikörperreaktionen auf heptozytenspezische Faktoren (HNF-4), Intermediärfilamente (CK18), Gap junctions (Co32) und Zellkerne (DAPI) nachgewiesen werden.

Disskussion: Wir konnten zeigen, dass die statische in vitro Hepatozytenkultur auch im 96-Well Format möglich ist und als Tool für ADMET-Studien verwendet werden kann. Trotz geringem Platzangebot konnten ausreichend Zellen kultiviert werden. Genanalysen, Überstandsmessungen, Histologie sowie Immunfluoreszenzen sind in der 3D Kultur im 96-Well Format möglich. Hydrophobe Polymereigenschaften konnten kompensiert werden. Die initial geringe Besiedlungseffizienz konnte gesteigert werden.

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