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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-59390
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5939/


Murine engineered heart tissue (EHT) as a tool for modeling cardiac diseases and angiogenesis screening

Künstliches Herzgewebe genetisch manipulierter Mäuse als Plattform für kardiale Phänotypanalysen und Gefäßbildungsstudien

Stöhr, Andrea

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SWD-Schlagwörter: Tissue Engineering , Punktmutation , Genmutation , Herzkrankheit , Muskelkontraktion , Angiogenese
Freie Schlagwörter (Deutsch): Kardiales Myosin-bindendes Protein-C (cMyBP-C), transgenes Mausmodell
Freie Schlagwörter (Englisch): Engineered heart tissue (EHT), disease modeling , Mybpc3-targeted knock-out and knock-in mice, cMyBP-C, angiogenesis
Basisklassifikation: 44.38 , 30.00 , 44.40 , 42.03
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Duchstein, Hans-Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 05.12.2012
Kurzfassung auf Englisch: Cardiac tissue engineering may provide improved test beds for preclinical drug development and surrogate heart muscle for tissue replacement therapy. This thesis addressed three important questions: (1) Is the established engineered heart tissue (EHT) format suitable for ‘in vitro disease modeling’, i.e. does it detect a phenotype of genetically determined cardiac diseases? (2) Do EHTs contain blood vessels and do they participate in vascularization after implantation? (3) Can this process be improved by angiogenic growth factors?
To answer these questions the fibrin-based rat EHT technology had to be adapted for neonatal mouse cardiac cells. To generate spontaneously beating murine EHTs some modifications were necessary, namely an increase in cell concentration, reduction in mastermix volume, the presence of Matrigel in the mastermix, insulin as a medium supplement, the use of a cell cycle inhibiting drug (AraC) between day 5-7 and the exclusive use of neonatal pups with an age of 0-1 day postnatal. Murine EHTs showed features of intact cardiac muscle in morphological, histological and pharmacological analyzes. To answer the first question the cardiac disease hypertrophic cardiomyopathy (HCM) was in the focus of interest. Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is frequently caused by mutations in MYBPC3 encoding cardiac myosin-binding protein C (cMyBP-C). Mybpc3-targeted knock-out (KO) or knock-in (KI) mice recapitulate typical aspects of HCM. The objective of this study was to evaluate whether functional alterations observed in Mybpc3-targeted KO or KI mice can be reproduced in engineered heart tissue (EHT) and yield novel mechanistic information on the function of cMyBP-C. EHTs were generated from hearts of neonatal KO, KI or respective wild-type control (WT) mice and developed without apparent differences. Contractile function was monitored under spontaneous beating and electrical stimulation (5-6 Hz). KO and KI EHTs developed higher peak force than WT under physiological Ca2+ concentration, but times of contraction and relaxation were shorter. KO and KI exhibited 5-fold lower sensitivity to the negative inotropic effect of the Ca2+-channel blocker verapamil and, at 0.6 mM Ca2+, nearly no (KO, +2%) or a reduced (KI, +33%) positive inotropic response to the Ca2+ sensitizer EMD 57033 compared to WT (+110%). Additionally, the positive inotropic and lusitropic effect of isoprenaline was blunted in KO. In conclusion, hypercontractility at physiological Ca2+ concentrations and shortened times of contraction and relaxation in Mybpc3-targeted murine EHT suggest that the role of cMyBP-C is to suppress weak and stabilize strong actin-myosin interactions. Reduced sensitivity to verapamil and EMD points towards important differences in drug responses of MYBPC3-related HCM. EHTs are a suitable test bed to study functional consequences of gene mutations. The present results shall be useful for future studies with induced-pluripotent stem cell (iPS)-mediated disease modeling of human HCM.
To answer the second and the third question, two transgenic mouse lines (BMX-/VE-Cadherin-Cre-ERT2-Rosa26-LacZ) were established in which endothelial cells (ECs) were specifically labeled in a tamoxifen-inducible, cell-specific manner. The BMX-model labels only a subfraction of ECs with an arterial phenotype, the VE-Cadherin model all ECs. EHTs generated from BMX neonatal mouse hearts showed labeled ECs aligned along the force lines scattered within the matrix. VE-Cadherin EHTs showed an extensive primitive, but distinct vascular network under standard EHT culture conditions. Under serum-free conditions, EC density in VE-Cadherin EHTs was 1,000-fold lower. Angiogenesis-modifying soluble or matrix-bound growth factors such as VEGF, PDGF or IGF did not increase EC density under standard or serum-free conditions in vitro. Transfection of VE-Cadherin EHTs with microRNA-24 had an angiogenesis-inhibiting effect. Murine EHTs served as grafts for implantation studies. Labeled cells from VE-Cadherin EHT grafts could be detected after 2 weeks in vivo, forming multicellular layers. Future studies are planned to investigate whether angiogenesis-inducing growth factors immobilized in the EHT matrix will improve vessel connection to the host myocardium.
Kurzfassung auf Deutsch: Kardiales ‚Tissue Engineering‘ könnte in der präklinischen Arzneistoffentwicklung ein Testsystem darstellen und als Herzmuskeläquivalent zum Gewebeersatz dienen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, drei wichtige Fragestellungen zu beantworten: (1) Eignet sich das Engineered Heart Tissue (EHT)-Format zur Krankheitsmodellierung? Ist es möglich, einen Phänotyp einer genetisch bedingten Herzerkrankung festzustellen? (2) Enthalten EHTs Blutgefäße und beteiligen sich diese nach Implantation an einer Gefäßneubildung und kann diese durch Wachstumsfaktoren verbessert werden?
Um diese Fragen zu beantworten, musste die bereits etablierte Fibrin-basierte Ratten-EHT-Technologie für neonatale Mausherzmuskelzellen angepasst werden. Folgende Faktoren erwiesen sich als kritisch: Erhöhte Zellkonzentration, Reduzierung des Mastermixvolumens, Anwesenheit von Matrigel, Insulin als Bestandteil des Mediums, Einsatz eines Zellzyklusinhibitors (AraC; Tag 5-7) und der ausschließliche Gebrauch von neonatalen Mäusen im Alter von Tag 0-1 postnatal. Murine EHTs zeigten Eigenschaften intakter Herzmuskulatur hinsichtlich Morphologie, Histologie und Pharmakologie. Um erstere Fragestellungen zu beantworten, wurde die hypertrophische Kardiomyopathie (HCM) untersucht, welche oft durch Mutationen im MYBPC3-Gen, das kardiales Myosin-bindende Protein-C (cMyBP-C) kodiert, ausgelöst werden kann. Zwei Mauslinien wurden als Modell für die HCM herangezogen. Eine davon bildet kein cMyBP-C (KO), bei der anderen ist eine häufige menschliche cMyBP-C Mutation in das Mausgenom insertiert worden (KI). Das Ziel war es, zu untersuchen, ob funktionelle Veränderungen, welche in KO- und KI-Mäusen beobachtet werden konnten, im EHT-Modell reproduziert werden können und ob neue mechanistische Informationen zur Funktion des cMyBP-C gefunden werden können. Für die EHT-Generierung wurden neonatale KO- und KI-Mäuse sowie entsprechende Wildtyp (WT)-Kontrollmäuse verwendet, welche sich ohne sichtliche Unterschiede entwickelten. Kontraktile Funktionsanalysen wurden unter spontanen Bedingungen oder unter elektrischer Stimulation (5-6 Hz) durchgeführt. KO- und KI-EHTs entwickelten unter physiologischen Ca2+-Konzentrationen höhere Kontraktionskräfte als WT, aber die Kontraktions- und Relaxationszeiten waren verkürzt. KO und KI zeichneten sich durch eine 5-fach reduzierte Empfindlichkeit gegenüber der negativ-inotropen Wirkung des Ca2+-Kanal-Blockers Verapamil aus, und zeigten, bei einer Ca2+-Konzentration von 0.6 mM, fast keine (KO, +2%) oder eine reduzierte (KI, +33%) positiv-inotrope Reaktion auf den Ca2+-Sensitizer EMD 57033 im Vergleich zu WT (+110%). Zusätzlich zeigten KO eine verminderte positiv-inotrope und -lusitrope Reaktion unter Isoprenalinstimulation. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Hyperkontraktilität unter physiologischen Ca2+-Konzentrationen und verkürzte Kontraktions- und Relaxationszeiten in murinen KO- und KI-EHTs darauf schließen lassen, dass die physiologische Aufgabe von cMyBP-C ist, schwache Actin-Myosin Interaktionen zu unterdrücken und starke Actin-Myosin Interaktionen zu stabilisieren. Verminderte Empfindlichkeiten auf Verapamil und EMD deuten auf wichtige Unterschiede in der Wirkungsintensität von Arzneistoffen bei der MYBPC3-basierten HCM hin. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass das EHT-Modell ein geeignetes Testsystem darstellt, um funktionelle Auswirkungen von Genmutationen zu untersuchen. Die vorliegenden Ergebnisse könnten für weitere Untersuchungen mit induziert-pluripotenten Stammzellen (iPS) zur Krankheitsmodellierung von menschlicher HCM bedeutsam sein.
Um die zweite Frage zu beantworten, wurden zwei transgene Mauslinien (BMX-/VE-Cadherin-Cre-ERT2-Rosa26-LacZ) etabliert, in denen Endothelzellen Tamoxifen-abhängig markiert werden können. Das BMX-Modell markiert nur eine Untergruppe mit „arteriellen“ Eigenschaften, das VE-Cadherin-Modell alle Endothelzellen. EHTs, welche aus neonatalen BMX-Mauseherzen generiert wurden, zeigten markierte Endothelzellen in der Matrix verteilt, welche sich entlang der Kraftlinien orientierten. VE-Cadherin-EHTs zeigten ein dichtes primitives, aber gerichtetes Netzwerk unter Standardkulturbedingungen für EHTs. Unter Serum-freien Kulturbedingungen war die Endothelzelldichte in VE-Cadherin-EHTs 1.000-fach geringer. Angiogenese-modifizierende, lösliche oder matrixgebundene Wachstumsfaktoren wie VEGF, PDGF oder IGF führten nicht zu einer erhöhten Endothelzelldichte, weder in An- noch Abwesenheit von Serum. Transfektion mit microRNA-24 hatte einen Angiogenese-hemmenden Effekt. Murine EHTs dienten als Implantate für Gewebeersatzstudien. Markierte Endothelzellen aus VE-Cadherin-EHTs konnten nach 2 Wochen in vivo detektiert werden und bildeten multizelluläre Schichten aus. In zukünftigen Studien soll untersucht werden, ob Angiogenese-induzierende Wachstumsfaktoren in der EHT-Matrix die Gefäßanbindung des EHTs an das native Myokard verbessern können.

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