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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-59514
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5951/


Charakterisierung der T-Zellantwort in der Experimentellen Autoimmunen Glomerulonephritisder Maus

Holzer, Julia

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Freie Schlagwörter (Deutsch): Nierenentzündung
Freie Schlagwörter (Englisch): glomerulonephritis
Basisklassifikation: 30.30
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Naturwissenschaften
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 05.10.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 10.12.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Die anti-glomeruläre-Basalmembran-Glomerulonephritis (anti-GBM-GN) ist eine
seltene Autoimmunerkrankung der Niere. In vielen anti-GBM-GN-Patienten zeigt sich zusätzlich eine Lungenbeteiligung, welche sich durch Lungenblutungen äußert. Wenn beide Organe betroffen sind, wird die Krankheit als Goodpasture-Syndrom bezeichnet. Unbehandelt endet die anti-GBM-GN fast immer mit dem Tod des Patienten. Der Pathomechanismus der anti-GBM-GN beruht auf der Bildung von Autoantikörpern und zusätzlich wird eine Beteiligung von T-Zellen vermutet. Die Autoimmunität richtet sich dabei gegen die Nicht-Kollagen-Domäne 1 (NC1) der α3- und α5-Kette des Typ IV Kollagens (α3(IV)NC1 und α5(IV)NC1). Autoantikörper binden an α3(IV)NC1 und α5(IV)NC1 in der Basalmembran in Niere und Lunge. In der Niere bilden sich dann typische, halbmondförmige, mononukleäre Infiltrate, die mit einer schweren Schädigung der Glomeruli und einer progressiven Niereninsuffizienz einhergehen. Demgegenüber ist die Bedeutung der T-Zellen für die Schädigung der Niere bislang unklar.
Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Mausmodells für die anti-GBM-GN. In diesem Modell, der Experimentellen Autoimmunen Glomerulonephritis (EAG), sollten dann verschiedene Aspekte der Pathogenese und der Immunantwort untersucht werden. Wesentliche Punkte waren die generelle Funktion der CD4+ T-Zellen sowie die Rolle der Th17-Zellen und der regulatorischen T-Zellen. Außerdem sollte untersucht werden, ob autoreaktive T-Zellen in der Maus vorhanden sind. Die zentrale Hypothese war, dass CD4+ T-Zellen den Verlauf der Erkrankung und den damit verbundenen Nierenschaden beeinflussen. In unserem EAG-Modell wurden DBA/1J-Mäuse mit rekombinantem Human-α3(IV)NC1 einmal in komplettem und dreimal in inkomplettem Freundschen Adjuvans immunisiert. Die Mäuse entwickelten als Folge eine schwere Proteinurie und ab Woche 8 eine GN mit letalem Funktionsverlust der Niere. Nach 2 Wochen waren α3(IV)NC1-spezifische Antikörper und nach 3 - 5 Wochen IgG-Ablagerungen entlang der GBM nachweisbar. In diesem Stadium zeigten die Nieren noch keine entzündlichen Veränderungen und nur eine marginale Infiltration von Leukozyten. Erst im späten Stadium entwickelten die Tiere glomeruläre Halbmonde in der Bowman-Kapsel, erhebliche Schäden der Tubuli und eine massive Infiltration von Makrophagen. Die Infiltration von T-Zellen war weniger stark ausgeprägt und hauptsächlich im Interstitium zu beobachten. Diese T-Zellen zeigten einen aktivierten Phänotyp und enthielten einen erheblichen Anteil an Th1- und Th17-Zellen. Um die generelle Funktion der T-Zellen und deren Subpopulationen zu klären, wurden verschiedene Versuchsansätze durchgeführt. Die Depletion von CD4+ T-Zellen in der späten Phase der EAG durch einen anti-CD4-Antikörper führte zu keiner Minderung der Nierenschädigung im Vergleich zu den Kontrolltieren. Eine Neutralisierung von IL-17A über den gesamten Versuchszeitraum der EAG zeigte ebenfalls keinen veränderten Verlauf in der Nierenentzündung. Dieses Ergebnis wurde durch eine Analyse von IL-17A ko-Mäusen bestätigt. In denen wurde auch kein Unterschied im Nierenschaden beobachtet. Die Depletion von regulatorischen T-Zellen in der späten Phase der EAG hatte auch keinen Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Im letzten Teil der Arbeit wurde versucht α3(IV)NC1-spezifische T-Zellen nachzuweisen. Nach Immunisierung konnten diese Zellen in der Milz mittels ELISpot identifiziert werden. Die Immunisierung mit einem immundominanten Peptid aus α3(IV)NC1 (P71) führte zur Induktion von P71- aber auch von α3(IV)NC1-spezifischen T-Zellen. In beiden Ansätzen waren die Frequenzen der autoreaktiven T-Zellen in der Milz sehr niedrig.
IV Zusammenfassend konnten wir das EAG-Modell etablieren und hochaktivierte T-Zellen in der Niere und α3(IV)NC1-spezifische T-Zellen in der Milz nachweisen. Um die Funktion der T-Zellen in der anti-GBM-GN zu klären, sind weitere Studien notwendig.
Kurzfassung auf Englisch: Anti-glomerular basement membrane (GBM) glomerulonephritis (GN) is a rare autoimmune kidney disease. This GN is often accompanied by lung haemorrhage and then commonly referred to as Goodpasture’s syndrome. Untreated, anti-GBM-GN is usually fatal for the patient. The formation of autoantibodies is considered to be the central pathomechanism of anti-GBM-GN. However, there is also evidence for the participation of T cells. Autoimmunity is directed against the noncollagen domain 1 (NC1) of the α3 and α5 chain from type IV collagen (α3(IV)NC1 and α5(IV)NC1). Autoantibodies bind to the α3(IV)NC1 and α5(IV)NC1 within the basement membrane in kidney and lung. In the kidney, this is followed by massive immune cell infiltration and glomerular crescent formation, indicating a severe and rapidly progressing injury. The function of T cells for renal damage is so far unclear.
The major aim of this work was the establishment of a mouse model for anti-GBM-GN. In this model, the experimental autoimmune glomerulonephritis (EAG), different aspects of the pathogenesis of the disease and the immune response within the kidney should be examined.
Central topics of research were the general function of the CD4+ T cells as well as the role of Th17 cells and regulatory T cells in progression of renal destruction. In addition, it should be examined whether T cells specific for peptide derived from the basement membrane could be identified in the mouse. The central hypothesis was that CD4+ Tcells affect progression of the disease and control renal damage. In our EAG model, DBA/1J mice were immunized with recombinant human α3(IV)NC1 in complete Freund’s adjuvant and boosted three times with human α3(IV)NC1 in incomplete Freund’s adjuvant. As consequence, mice developed a severe proteinuria and starting from week 8, a glomerulonephritis with fatal loss of kidney function. After 2 weeks, α3(IV)NC1-specific antibodies were detectable, and after 3 - 5 weeks mice displayed IgG deposits along the GBM. However, at this stage the kidneys showed only marginal infiltration of leukocytes and limited signs of inflammation. Only in the late stage, the animals developed glomerular crescents in the Bowman’s capsule, extensive tubulointerstitial damage and massive infiltration of macrophages. Infiltration of T cells was less pronounced and mainly observed in the interstitium. These T cells showed an activated phenotype and contained a substantial portion of Th1 and Th17 cells. To clarify the general function of T cells and of their subpopulations, different experiments were performed. The depletion of CD4+ T cells in the late phase of EAG by an anti-CD4 antibody did not cause a reduction of kidney damage compared with control animals. Neutralization of IL-17A during the whole immunization and observation period of EAG showed likewise no alteration in the kidney inflammation. This result was confirmed by an analysis of IL-17A ko mice, in which also no difference in the kidney damage was observed. The depletion of regulatory T cells in the late phase of EAG had also no influence on disease progression. In the last part of the work, we tried to identify α3(IV)NC1-specific T cells in immunized mice. Using IFNγ-ELISpot, cells were detected in the spleen of mice immunized with α3(IV)NC1. The immunization with an immune-dominant peptide derived from α3(IV)NC1 (P71) led to the induction of P71- and α3IVNC1-specific T cells. In both approaches, frequencies of the autoreactive T cells in the spleen were however very low. In summary, we could establish the EAG model and identify highly activated T cells in the kidney and α3(IV)NC1-specific T cells in the spleen. The funtion of T cells in the anti-GBMGN could not be revealed so far, therefore, further studies are necessary.

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