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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-59792
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2012/5979/


Charakterisierung von Carbapenem-Resistenzmechanismen bei klinischen Isolaten aus der Familie der Enterobacteriaceae

Weinberg, Jens

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SWD-Schlagwörter: Enterobacter cloacae , Beta-Lactam-Resistenz , Multidrug-Resistenz , Lactamase <beta-> , Imipenem , Meropenem
Freie Schlagwörter (Deutsch): Klebsiella pneumoniae , OXA-48 , Carbapenem-Resistenz , Ertapenem , Carbapeneme
Freie Schlagwörter (Englisch): carbapenem resistance , OXA-48 , beta-lactamase , resistance mechanism , clinical isolates
Basisklassifikation: 42.30 , 44.41 , 42.13 , 44.43 , 35.70
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Medizin, Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Heisig, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.12.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 19.12.2012
Kurzfassung auf Deutsch: Die zunehmende Resistenz bakterieller Krankheitserreger gegen gängige Antibiotika-Klassen wird ein immer größeres Problem der modernen Medizin und fordert auch in steigendem Maße Menschenleben. Die immer weiter voranschreitende Resistenzentwicklung auch gegen die Klasse der Beta-Lactam-Antibiotika ist dabei besonders erwähnenswert, weil diese nach wie vor als die wichtigste Waffe gegen bakterielle Infektionen angesehen wird. Zu den Unterfamilien der Beta-Lactam-Antibiotika gehören unter anderem die Carbapeneme. Zeichneten sich die Carbapeneme lange Zeit durch ihre generell hohe Stabilität gegen verbreitete Beta-Lactamasen aus, bricht dieser Zustand gegenwärtig zunehmend um: es werden immer mehr Beta-Lactamasen nachgewiesen, die auch Carbapeneme zu ihrem Substratspektrum zählen.
Wie bei allen auftretenden Resistenzmechanismen ist es auch bei der Carbapenemresistenz die Aufgabe der Wissenschaft, diese zu untersuchen und zu analysieren, um Erkenntnisse über ihre Entstehung, ihren Mechanismus und ihre Ausbreitung zu gewinnen. Aus solchen Erkenntnissen lassen sich epidemiologische Prognosen erstellen, man kann Schlüsse für die Therapie ziehen und auch neue, gegebenenfalls robustere Ansätze für neue Antibiotika finden.
In dieser Arbeit wurden klinische Isolate der Familie der Enterobacteriaceae untersucht, die durch eine Resistenz gegen Carbapeneme auffällig geworden sind. Dabei handelte es sich zum einen um ein Isolat-Kollektiv der Spezies E. cloacae sowie zum anderen um ein Isolat der Spezies K. pneumoniae.
Bezüglich der E. cloacae, deren Isolation sukzessive von einer einzelnen Patientin erfolgte, konnte gezeigt werden, dass ihre Carbapenemresistenz primär durch die Expression der Metallo-Beta-Lactamase VIM-1 verursacht wird. Diese MBL zählt inzwischen zu den weltweit häufigsten Ursachen von Carbapenemresistenz. Wie weiter gezeigt werden konnte, ist das Gen Teil eines Integrons auf einem ca. 50 kb großen, konjugativen Plasmid. Diese Konstellation verkörpert gleich zwei sehr verbreitete Ausbreitungsmechanismen von Resistenzgenen.
Weitere Untersuchungen ließen darauf schließen, dass vermutlich eine Punktmutation im Gen ampD der E. cloacae zu einer erhöhten ampC-Expression führte, die ihrerseits das Resistenzprofil auf die übrigen Unterklassen der Beta-Lactam-Antibiotika erweiterte.
Bei der K. pneumoniae konnte das Carbapenemase-Gen blaOXA-48 nachgewiesen werden. Damit verfügt dieses Isolat über eine Beta-Lactamase, bei der man von einer zunehmenden Ausbreitung auch in Deutschland ausgehen kann. Das hier untersuchte Isolat stellt das momentan Älteste in Deutschland dar, bei dem dieser Nachweis gelungen ist. Das Gen wurde 2004 zuerst in einem türkischen Isolat von 2002 beschrieben, während das hier untersuchte Isolat von 2004 stammt.
Wie gezeigt werden konnte, ist das Carbapenemase-Gen blaOXA-48 auf einem konjugativen, ca. 62 kb großen Plasmid lokalisiert. Dieses Plasmid zeigte identische Bandenmuster nach Spaltung mit Restriktionsenzymen wie das Referenzplasmid pOXA-48a aus dem Isolat K. pneumoniae 11978, bei dem der Erstnachweis von blaOXA-48 gelang. Man kann anhand der Ergebnisse dieser Arbeit davon ausgehen, dass die Plasmide identisch sind. Dies passt zu einer gängigen Theorie, nach der die Ausbreitung von blaOXA-48 primär durch dieses Plasmid vorangetrieben wird.
Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass das Isolat die Hauptporine OmpK35 und OmpK36 nicht bildet, was zu einer Verstärkung der Beta-Lactam-Resistenz im Allgemeinen und der Carbapenemresistenz im Besonderen führt. Die Poringene ompK35 und ompK36 zeigten eine Insertion bzw. Deletion von DNA in ihren jeweiligen Promotoren, was die Ursache für das Fehlen der Porine ist.
In weiteren Versuchen wurde gezeigt, dass es einen starken Synergismus zwischen Porinverlust und der Expression von blaOXA-48 gibt. Erst die Kombination aus beiden Resistenzmechanismen lässt einen Stamm von K. pneumoniae als phänotypisch resistent erscheinen, wobei die Ergebnisse sicherlich auf andere Enterobakterien übertragbar sind. Diese Erkenntnis legt einen pauschalen Test auf blaOXA-48 bei klinischen Isolaten aus dieser Familie nahe, auch wenn sie sensibel gegen Carbapeneme sind. Ein Einsatz von Carbapenemen schließt sich bei positivem Ergebnis in jedem Fall aus, da er zu einer Selektion porindefizienter und damit hochresistenter Stämme führen kann.
Die Arbeit gewährt einen aktuellen Einblick in die Verbreitung von gegenwärtig hochproblematischen Resistenzgenen gegen die Antibiotikaklasse der Carbapeneme. Sie trägt ferner zum weitergehenden Verständnis dieser Resistenzmechanismen bei.
Kurzfassung auf Englisch: The increasing resistance against most of the current available classes of antibiotics is a major concern of modern medicine and is one the leading causes of global death. The progressing evolution of resistance mechanisms against the class of beta-lactam-antibiotics is particular notable since this class still is one of the most important weapons against bacterial infections. A subclass of beta-lactam-antibiotics is formed by the carbapenems. Although they have been seen as very stable against widespread beta-lactamases since their introduction, this situation is currently changing: an increasing number of beta-lactamases is detected which are able to hydrolyze carbapenems.
As with all appearing resistance mechanisms, it is the challenge of scientists to examine and analyze the mechanisms behind a carbapenem resistance in order to understand their evolution and epidemiology. With these insights it is possible to develop epidemiological projections, to optimize therapy schemes and to find new, perhaps more robust approaches for the development of new antibiotics.
In this work clinical isolates of the family of Enterobacteriaceae showing carbapenem resistance were examined. Those were a collective of E. cloacae on one hand and a single K. pneumoniae on the other.
Regarding the E. cloacae, which have been isolated from a single patient, it could be shown that their carbapenem resistance is primarily due to the expression of the metallo-beta-lactamase VIM-1. This MBL is one of the most frequent causes of carbapenem resistance worldwide. Here, the gene is part of an integron on a conjugative plasmid with an approximate size of 50 kb. This constellation represents even two very common mechanisms of dissemination of resistance genes.
Further examinations showed that a point mutation in ampD of the E. cloacae might lead to an increased expression of ampC, thus extending the resistance profile over the other classes of beta-lactam-antibiotics.
The K. pneumoniae isolate was found to be positive for the carbapenemase resistance gene blaOXA-48. Therefore this isolate owns a beta-lactamase which is considered to experience an increasing dissemination. The isolate examined here currently is the oldest in Germany being positive for this gene. It first was described in 2004 and found in an isolate from Turkey from 2002, while the K. pneumoniae of this work is from 2004.
It could be shown that the carbapenemase gene is located on a conjugative plasmid with an approximate size of 62 kb. This plasmid yielded an identical pattern of DNA fragments like the reference plasmid pOXA-48a from the isolate of first detection, K. pneumoniae 11978, when both were digested with restriction enzymes. One can conclude that the plasmids are identical. This fits to the popular theory of the dissemination of blaOXA-48 primarily by this single plasmid.
Furthermore it was found that the isolate is not expressing both its major outer membrane porins OmpK35 and OmpK36, leading to an enhanced beta-lactam-resistance, especially against carbapenems. The porin genes ompK35 and ompK36 both showed a DNA-insertion and a DNA-deletion respectively in their promoter regions, which is the cause for the missing porins.
Further experiments showed that there is a strong synergism between the loss of porins and the presence of blaOXA-48. Only the combination of both mechanisms is leading to the carbapenem resistance phenotype. The results should also apply for other species of Enterobacteriaceae. These findings suggest establishing a standard assay for the detection of blaOXA-48 in clinical isolates from this family, even if they first seem to be susceptible to carbapenems. The use of carbapenems should be excluded if the result is positive, since it could lead to the selection of porin deficient and therefore highly resistant strains.
This work allows for a present insight into the dissemination of currently highly problematic resistance genes regarding the antibiotic class of carbapenems. It further helps on the detailed understanding of these resistance mechanisms.

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