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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-60656
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6065/


Mechanism and Inhibition of Fucosyltransferases

Mechanismus und Inhibition von Fucosyltransferasen

Kötzler, Miriam P.

Originalveröffentlichung: (2012) Insect Biochemistry and Melecula Biology (DOI: 10.1016/j.ibmb.2011.11.004), Biochimica et Biophysica Acta (DOI: 10.1016/j.bbagen.2012.08.018)
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SWD-Schlagwörter: Glycoproteinfucosyltransferase <Glycoprotein-6-alpha-L-fucosyltransferase> , NMR-Spektroskopie , Epitop , Substrat <Chemie> , Dynamische Modellierung
Basisklassifikation: 35.63 , 35.74 , 35.73 , 35.51 , 35.39
Institut: Chemie
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Meyer, Bernd (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.12.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 22.02.2013
Kurzfassung auf Englisch: The products of fucosyltransferases are fucosylated oligosaccharides that are involved in many physiological and pathophysiological processes. Here the alpha1,3-fucosyltransferase FUTA and the alpha1,6-fucosyltransferase FUT8 are analyzed in detail. Information on the structure and detailed mechanism of fucosyltransferases is, however, scarce. Because of the biological importance specific inhibitors for these enzymes would be of high interest.
Both fucosyltransferases studied here act on the proximal GlcNAc of N-glycans. Honeybee (A. mellifera) FucTA, the key enzyme in biosynthesis of the immunogenic core-alpha1,3-fucosyl epitope, was studied to get – without X-ray structure analysis – information on the enzyme’s mechanism, the binding of the substrate and the kinetics of the enzyme. Both structure and reaction mechanisms that lead to the formation of the epitope were analyzed by biophysical methods. Donor (GDP-Fuc) and acceptor (a complex type heptasaccharide) binding to FucTA were elucidated with STD NMR, SPR and enzyme kinetic methods. These results demonstrate that FucTA binds GDP-Fuc mainly via the guanosine part and also via the pyrophosphate. As acceptor substrates FucTA prefers N-glycans that are not core alpha1,6- fucosylated. Furthermore, a large binding epitope with emphasis on the core pentasaccharide was found for the acceptor substrate, indicating that FucTA recognizes a large part of the heptasaccharide. Progress curve analysis of FucTA by NMR was established to determine the enzyme kinetics of FucTA. FucTA was used to prepare and characterize mg amounts of core alpha1,3-fucosylated N-glycans. With these compounds, that are difficult to access otherwise, recognition of the immunogenic structure by polyclonal antibodies directed against CCD was analyzed by means of STD NMR and it was found that these antibodies bind mainly the core structure Fuc2GlcNAc of the N-glycans.
In order to design specific inhibitors, structural information on substrate recognition with atomic resolution and on the catalytic mechanism is required. Human FUT8 was chosen since a crystal structure of the apo enzyme was available. Ligand based NMR analysis in combination with in silico methods yielded a model of donor substrate binding of human FUT8. The model of the complex provides detailed insight into substrate–enzyme contacts and is consistent with experimental data from NMR and SPR studies and also with prior mutation studies. The results suggest that GDP-Fuc is recognized in a highly specific manner by hydrogen bonds of guanine with the side chain of the essential Asp453 and the side chain of His363. Binding affinity of the donor molecule to FUT8 is dependent on the beta-phosphate
group as found by SPR experiments in this study. Compared to FucTA, binding of the guanine is less pronounced, indicating a different recognition process. The model provides the structural basis for this finding with multiple very stable hydrogen bonds that the pyrophosphate moiety of the donor forms with the amide functions of the backbones in the Rossman fold. The fucose moiety points towards a shallow region that is able to accommodate the acceptor molecule of FUT8. Finally, the model presented on the FUT8–
GDP-Fuc complex gives implications for the role of the essential Arg365: Besides binding of the beta-phosphate, Arg365 assists in GDP release and proper orientation of the fucose residue for nucleophilic attack of the acceptor. The specific interactions of Arg365 and of Gln470 with the fucose also ensure discrimination between GDP-Fuc and GDP-Man.
In the next step, the model was extended to the binding of the acceptor substrate. Like for FucTA, an unusually large acceptor is required as minimal structure. Acceptor substrate binding of FUT8 was experimentally studied by STD NMR and SPR and theoretically by molecular dynamics simulations. The acceptor binding site was identified as shallow cavity between the Rossman fold, a very flexible loop and the C-terminal beta-strands. Compared to the
donor, the acceptor has a faster kinetics of dissociation. In addition, binding of the acceptor was found to be much faster and stronger if the donor is present. This is due to strong hydrogen bonding between the O-6 of the proximal GlcNAc and an oxygen atom of the beta-phosphate of GDP-fucose. From these data, an ordered bi-bi-mechanism for FUT8 is proposed where the donor molecule is the leading substrate. No specific amino acid is present that could act as base during catalysis. The experimental and theoretical results indicate a substrate-assisted mechanism, where a beta-phosphate oxygen deprotonates the acceptor. The specific recognition of the complex acceptor substrate is also provided by the flexible loop which binds the 6-mannose branch and by specific amino acids of beta-11 and the flexible loop that are in contact with the 3-mannose branch of the acceptor substrate.
Finally, the knowledge on substrate recognition and enzymatic mechanism of FUT8 was used to design a specific inhibitor based on chitotriose, which represents a weakly active acceptor substrate for FUT8 that can more easily be chemically modified than the natural acceptor. Enzyme kinetics of the transfer of fucose to chitotriose revealed that the affinity to this substrate is very low. These results were further supported with in silico methods, indicating less persistent key interactions for the core chitobiose unit. With the help of this model, a derivative of chitobiose was developed that is able to block the key catalytic residue Arg365. Ultimately, a synthetic strategy for this compound was developed.
Kurzfassung auf Deutsch: Die Produkte der Fucosyltransferasen sind an einer Vielfalt von wichtigen biologischen Prozessen beteiligt. Es ist daher von großem Interesse, spezifische Inhibitoren für diese Enzyme zu entwickeln. Die dafür benötigten detaillierten Informationen über Struktur und Mechanismus sind jedoch größtenteils noch nicht verfügbar. Daher ist das strukturbasierte Design spezifischer Inhibitoren für einzelne Fucosyltransferasen sehr schwierig.
In dieser Arbeit wurden zwei Fucosyltransferasen untersucht, die das proximale GlcNAc von N-Glycanen modifizieren. Das bestehende Expressionssystem für die FucTA der Honigbiene, das Schlüsselenzym in der Biosynthese des immunogenen core-alpha1,3-Fucosylepitops, bildete
die Basis um die komplexen Mechanismen der Biosynthese und der Erkennung dieser Strukturen durch das Immunsystem zu untersuchen. Sowohl die Strukturen als auch die Reaktionsmechanismen, die zu der Bildung des Epitops führen, wurden mit biophysikalischen Methoden untersucht. Dabei wurden die Bindung von Donorsubstrat (GDP-Fuc) und
Akzeptorsubstrat (ein Heptasaccharid vom komplexen Typ) an FucTA mit STD-NMR-Spektroskopie, SPR und enzymkinetischen Methoden untersucht. Die Ergebnisse zeigen dass FucTA GDP-Fuc hauptsächlich über das Guanosin und zusätzlich über das Pyrophosphat erkennt. Im Falle des Akzeptorsubstrats wird eine Struktur bevorzugt, die nicht bereits am
Kern alpa1,6-fucosyliert ist. Außerdem wurde ein ausgedehntes Bindungsepitop bestimmt, das zeigt, dass FucTA einen großen Teil seines Akzeptorsubstrats bindet. Diese Daten beleuchten die allgemeinen Prinzipien, die der Biosynthese und Modifikation von Glycanstrukturen
zugrunde liegen. Außerdem konnten mit der Untersuchung von FucTA wertvolle Werkzeuge, wie die Progresskurvenanalyse für Glycosyltransferasereaktionen mit NMR, etabliert werden. Weiterhin konnten die Substrate, also reduzierende und 1-beta-N-acetylierte N-Glycane, die für
die Untersuchung von FucTA in dieser Arbeit dargestellt wurden, für die enzymatische Synthese von mg-Mengen der sonst schwierig zugänglichen core-alpha1,3-fucosylierten NGlycane in genutzt werden. Mit diesen Verbindungen konnte die Erkennung der immunogenen Struktur durch polyklonale anti-CCD-Antikörper mit Hilfe von STD NMR untersucht werden und gezeigt werden, dass diese hauptsächlich die Kernregion des NGlycans
erkennen.
Um spezifische Inhibitoren zu entwickeln wird strukturelle Information der
Substraterkennung und des Katalysemechanismus mit atomarer Auflösung benötigt. Es wurde humane FUT8 gewählt, da zu dieser bereits eine Kristallstruktur des Apoenzyms veröffentlicht war. Die Kombination aus ligandbasierten NMR-Methoden und in-silico Studien lieferte ein Modell der Donorsubstratbindung von FUT8. Dieses Modell zeigt detaillierte Kontakte zwischen Enzym und Substrat und stimmt sowohl mit den experimentellen Ergebnissen der NMR- und SPR-Studien als auch mit denen aus früheren
Mutationsstudien überein. Die Ergebnisse zeigen dass GDP-Fuc hochspezifisch über Wasserstoffbrückenbindungen des Guanins mit den Seitenketten von Asp453 und His363 erkannt wird. Weiterhin konnte mit SPR herausgefunden werden, dass die Bindungsaffinität des Donormoleküls von der beta-Phosphatgruppe abhängig ist. Im Modell wird diese Erkenntnis
strukturell durch die Anwesenheit mehrerer fester Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem Pyrophosphat und den Amidfunktionen des Peptidrückgrats in der Rossmanfalte erklärt. Die Fucoseeinheit von GDP-Fuc zeigt in eine flache Region, die groß genug ist, um den Akzeptor unterzubringen. Schließlich liefert das Modell Hinweise auf die essentielle Funktion von Arg365: Außer der Bindung des beta-Phosphats hilft dieser Rest bei der Aktivierung von GDP als Austrittsgruppe und sorgt für die richtige Orientierung des Fucoserestes für einen nukleophilen Angriff durch den Akzeptor. Die spezifischen Wechselwirkungen von Arg365
und Gln470 mit der Fucose garantieren außerdem die Unterscheidung zwischen GDP-Fuc und GDP-Man.
Im nächsten Schritt wurde das Modell auf den ternären Komplex erweitert. Wie FucTA benötigt FUT8 einen außergewöhnlich großen Akzeptor als Minimalstruktur. Die Akzeptorsubstratbindung wurde experimentell mit STD NMR und SPR und theoretisch mit MD-Simulationen untersucht. Die Akzeptorsubstratbindungstasche wurde als eine flache Vertiefung zwischen Rossmannfalte, einer flexiblen Schleife und den C-terminalen beta-Strängen identifiziert. Verglichen mit dem Donor weist der Akzeptor eine schnellere
Assoziations- und Dissoziationskinetik auf. Außerdem wurde herausgefunden, dass die Akzeptorbindung in Anwesenheit des Donors deutlich stärker ausfällt. Der Grund dafür wurde eine starke Wasserstoffbrückenbindung zwischen dem O-6 des proximalen GlcNAcs
und einem Sauerstoffatom des beta-Phosphats im ternären identifiziert. Aus diesen Daten ergibt sich ein geordneter Bi-Bi-Mechanismus in dem der Donor das führende Substrat ist. FUT8 weist keinen Aminosäurerest auf, der als Base während der Katalyse infrage kommt. Die experimentellen und theoretischen Ergebnisse dieser Arbeit legen einen substratunterstützten
Mechanismus nahe, bei dem ein Sauerstoff der Phosphatgruppe den Akzeptor deprotoniert. Die spezifische Erkennung des Akzeptorsubstrats wird weiterhin über Aminosäuren der flexiblen Schleife, die den 6-Man-Arm binden, und der beta-Stränge, die im Kontakt mit dem 3- Man-Arm stehen, erzielt.
Schließlich wurden die detaillierten Erkenntnisse über die Substraterkennung und den enzymatischen Mechanismus genutzt um einen spezifischen Inhibitor, basierend auf Chitotriose, zu entwerfen. Chitotriose ist ein schwach aktives Akzeptorsubstrat für FUT8, der einfacher chemisch modifiziert werden kann als der natürliche Akzeptor. Es wurde herausgefunden, dass die Affinität für Chitotriose sehr schwach ist und dieses im in-silico- Modell weniger dauerhafte Schlüsselinteraktionen aufweist als die entsprechende Chitobioseeinheit im natürlichen Akzeptor. Mithilfe dieses Modells wurde ein Derivat der Chitotriose entworfen, die den für die Katalyse essenziellen Rest Arg365 blockiert. Schlussendlich wurde eine Synthesestrategie für diese Verbindung ausgearbeitet.

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