Untersuchungen zum Verständnis der biologischen Funktion des eukaryotischen Initiationsfaktors 5A (eIF-5A) und dessen Hypusinmodifikation

Abstract

Der eukaryotische Initiationsfaktor 5A (eIF-5A) ist für das Überleben und die Proliferation eukaryotischer Zellen essentiell. Er ist außerdem an der Pathogenese verschiedener Krankheiten wie Krebs, Diabetes Typ II und der HIV-Infektion beteiligt. Die molekularen Grundlagen dieser Funktionen sind jedoch bisher überwiegend unbekannt. Nicht zuletzt aus diesem Grund konnte bisher – trotz des großen Potentials von eIF-5A als Zielstruktur innovativer therapeutischer Interventionen für diese Krankheiten – keine darauf basierende neue Therapie entwickelt werden. Hinzu kommt, dass eIF-5A das einzige bekannte Ziel des Synthesewegs einer posttranslationalen Modifikation darstellt, der Aminosäure Hypusin. Die in zwei enzymvermittelten Schritten ablaufende Synthese dieser Modifikation findet in allen eukaryotischen Zellen statt und beeinflusst die eIF-5A-Funktion, auch im Hinblick auf die oben genannten Krankheiten, maßgeblich. Die dabei zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sowie der Einfluss des zweiten, durch die Deoxyhypusin Hydroxylase (DOHH) vermittelten Schritts der Hypusinsynthese sind jedoch weitgehend unklar. Die Zielsetzung dieser Arbeit war daher, den Einfluss der DOHH-Funktion auf den Säugerorganismus in vivo zu untersuchen. Dafür wurde ein konditionales knock-out (KO) Mausmodell für das Dohh-Gen etabliert und die Auswirkung des DOHH-Verlusts während der Embryonalentwicklung und im adulten bzw. juvenilen Tier untersucht. Dabei konnten verschiedene Erkenntnisse gewonnen werden: Erstens ist der Verlust des Dohh-Gens bereits zwischen den Tagen 3,5 und 9,5 der Embryogenese rezessiv letal. Der Verlust nur eines Dohh-Allels bewirkt postnatal eine geringe, aber signifikante Verringerung des Wachstums und hat einen negativen Einfluss auf die Hämatopoese in der Milz adulter Tiere. Durch den Einsatz eines induzierbaren KO wurde außerdem entdeckt, dass der Verlust des Dohh-Gens auch in drei bis vier Wochen alten Tieren einen rezessiv letalen Phänotyp verursacht. Anhand einer aus diesem Modell etablierten Fibroblasten-Zelllinie konnte schließlich gezeigt werden, dass auf der zellbiologischen Ebene zelluläre Seneszenz als Folge des DOHH-Verlusts ein Faktor in der Entstehung der beobachteten Phänotypen ist. Des Weiteren wurde nach Hinweisen auf die molekularen Grundlagen dieser Beobachtungen sowie der Funktionen von eIF-5A gesucht. Dafür sollten Interaktionspartner der eIF-5A Isoformen und der Enzyme der Hypusinsynthese identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde eine hochsensitive Methode etabliert: Bioreaktor-TAP-MS/MS. Aus den damit identifizierten 261 Proteinen konnte ein umfassendes Interaktionsnetzwerk für alle vier an der Hypusin-synthese beteiligten Proteine, also die zwei Isoformen von eIF-5A (eIF-5A1 und eIF-5A2), DHS und DOHH konstruiert werden. Einige der Interaktionen wurden erfolgreich durch zellbiologische und proteinbiochemische Methoden bestätigt. Das Netzwerk wurde außerdem durch bioinformatische Methoden wie zum Beispiel die Cluster-Analyse ausgewertet. Aus diesen Untersuchungen folgte, dass die potentiellen Interaktionspartner der Zielproteine vor allem an der Proteinsynthese, dem RNA-Transport und Metabolismus sowie der Zellzyklusregulation beteiligt sind. Die für eIF-5A2 spezifischen Interaktionspartner gaben zudem Hinweise auf hypothetische, physiologische sowie pathologische, gewebsspezifische Funktionen dieser Isoform. Solche Funktionen waren aufgrund des Expressionsmusters dieser Isoform prospektiv vermutet worden. Diese Arbeit beschreibt ein vielseitig einsetzbares Tiermodell für die translationale biomedizinische Erforschung der Hypusinmodifikation, sowie mit dem Protein-Interaktionsnetzwerk eine umfangreiche Ressource zum Verständnis der molekularen Mechanismen sowohl bekannter als auch bisher unentdeckter zellulärer Funktionen des Proteins eIF-5A.

Eukaryotic initiation factor 5A (eIF-5A) is essential for the survival and proliferation of eukaryotic cells. It is also involved in the pathogenesis of various diseases, including cancer, diabetes, and HIV-1 infection, making eIF-5A a promising drug target. Unfortunately, due to the lack of understanding of the molecular mechanisms underlying eIF-5A’s functions, it has not yet successfully been targeted in novel therapeutic approaches to the treatment of the aforementioned diseases. eIF-5A is the only known target for a specific posttranslational modification, resulting in the formation of the natural amino acid hypusine. The two-step synthesis of hypusine occurs in all eukaryotic cells and influences both normal eIF-5A function as well as its involvement in disease pathogenesis. The effects of and molecular basis behind the second step of hypusine synthesis, catalyzed by deoxyhypusine hydroxylase (DOHH), are elusive in higher eukaryotes. The main goal of this study was to gain insight into the function of DOHH in vivo. A conditional knockout (KO) mouse model of Dohh was established and used to study the effect of Dohh loss during organismal development. This approach led to two main findings: First, the loss of Dohh is recessively lethal during early embryogenesis, between 3.5 and 9.5 dpc. Second, the loss of only one allele is not lethal but elicits a minor lag in organismal growth and a negative effect on spleen hematopoiesis. The recessively lethal phenotype also emerged after the conditional Dohh KO in seven to eight week old animals, three to four weeks after induction. A fibroblast cell line was established from this conditional KO mouse strain. These cells showed reduced growth upon loss of Dohh. Several pieces of evidence suggest that this growth phenotype is triggered by cellular senescence. The search for the molecular mechanisms of these observations, as well as of the eIF-5A’s general function, constitutes the second part of this study. To this end, unknown protein-protein interactions (PPI) of eIF-5A1, eIF-5A2, DHS, and DOHH were identified using a novel and highly sensitive method: ‘bioreactor-TAP-MS/MS’. An interaction network of the 261 identified proteins was constructed and analyzed for clusters of functionally related proteins. Proteins directly or indirectly interacting with the hypusine-related bait proteins were mainly active in protein synthesis, RNA transport and metabolism, as well as regulation of the cell cycle. These data provide support for understanding previously observed roles and hypothesized functions of eIF-5A. Moreover, specific interaction partners of eIF-5A2 indicate hypothetic tissue-specific functions of this protein. In conclusion, this study presents a versatile animal model for translational biomedical research of the hypusine modification, as well as a comprehensive interactome map of all proteins involved therein.