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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-61083
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6108/


Identifizierung von LINE-1 kodierten Proteinen und zellulärer Interaktionspartner im humanen Gewebe

Buschmann, Christian

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Basisklassifikation: 42.13
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Dobner, Thomas (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 25.01.2013
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 22.04.2013
Kurzfassung auf Deutsch: LINE-1 (L1) Retrotransposons machen etwa 17% des menschlichen Genoms aus und spielen eine signifikante Rolle bei der Gestaltung des Genoms in Säugetieren. Um die Mechanismen der mutagenen Einflüsse von L1 auf das Genom besser zu verstehen, wurden die beiden L1 kodierten Proteine ORF1p und ORF2p, die an der L1-Retrotransposition beteiligt sind, im Rahmen dieser Arbeit eingehender untersucht.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden polyklonale Antikörper (AK) zur Detektion von L1-ORF1p und L1-ORF2p hergestellt. Die Immunisierung von Kaninchen mit L1-ORF1p und von Hühnern mit Peptiden aus der Endonukleasedomäne von ORF2p wurde von Eurogentec (Seraing, Belgien) durchgeführt. Die Spezifität des anti-ORF1p AK wurde in Immunblotanalysen gegen überexprimiertes ORF1p und gegen Zellextrakte verschiedener Tumorzelllinien, sowie in immunhistochemischen Färbungen und Immunfluoreszenzanalysen von menschlichen Geweben und Zelllinien nachgewiesen. Im Vergleich mit dem in der Literatur beschriebenen anti-ORF1p AK AH40.1 zeigte der neue anti-ORF1p AK eine mindestens vergleichbare Signalstärke bei gleichzeitig deutlich höherer Signalspezifität. Der anti-ORF2p AK wurde mit der Wasser-Verdünnungsmethode aus Hühnereigelb isoliert. Die Spezifität des anti-ORF2p AK wurde durch Immunpräzipitation überprüft. Ein ∼130 kDa- und ein ∼45 kDa-Polypeptid konnten mit dem anti-ORF2p AK aus HDMEC-Zelllysat präzipitiert und nach massenspektrometrischer Untersuchung L1-ORF2p kodierten Proteinen zugeordnet werden.
In immunhistochemischen Untersuchungen von Hodengewebe erwachsener Individuen mit den beiden oben charakterisierten AK konnte eine Koexpression von L1-ORF1p und L1-ORF2p in Spermatozyten II, unreifen Spermatiden, Sertolizellen, Residualkörperchen, Leydigzellen und Endothelzellen nachgewiesen werden. Koexpression von L1-ORF1p und L1-ORF2p konnte außerdem in Prospermatogonien, Leydigzellen und vaskulären Endothelzellen des fötalen Hodens (18/28 Wochen), Epithelzellen und vaskulären Endothelzellen des fötalen Nebenhodens (28 Wochen), sowie in Synzytiotrophoblasten und vaskulären Endothelzellen von Plazentagewebe detektiert werden.
Die intrazelluläre Lokalisation wurde mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht und ergab eine Kolokalisation von endogenem ORF1p und ORF2p in granulären Strukturen sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern von 2102Ep-Zellen.
Menschliche Zelllinien zeigen starke Unterschiede in der Retrotranspositionsfrequenz von L1. Differentiell exprimierte Wirtsproteine, die direkt an der L1-Retrotransposition beteiligt sind, könnten die Ursache für diese Beobachtung sein.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Köderkonstrukt für eine enzymatisch-inaktive Endonukleasedomäne (EN) des L1-ORF2p in den "bait"-Vektor pGBKT7 (BD Clontech, Frankreich) für eine Hefe 2-Hybrid Analyse kloniert. Durch einen X-Gal Filtertest konnte eine intrinsische Aktivierung der Reportergene des Matchmaker System 3 (BD Clontech, Frankreich) durch obiges Köderkonstrukt ausgeschlossen werden.
Aus einer cDNA-Genbank aus menschlichen Hoden (elf Männer im Alter von 11 - 61 Jahren) konnten mit Hilfe einer Hefe 2-Hybrid Analyse einhundertachtunddreißig potentielle Interaktionspartner der L1-EN isoliert werden. Von diesen einhundertachtunddreißig Kandidaten wurden diejenigen dreiundzwanzig Kandidaten weiter untersucht, die für eine cDNA von mindestens 200 bp Länge kodierten. Nach Ausschluss von fünfzehn falsch-positiven Kandidaten durch einen genetischen Test auf intrinsische Aktivierung der Reportergene HIS3, ADE2 und MEL1 wurden die verbliebenen acht cDNAs sequenziert und die editierten cDNA-Sequenzen durch in-silico Analysen mittels des BLAST-Algorithmus mit öffentlichen Datenbanken verglichen. Zwei cDNAs konnten dem Acrosin-bindenden Protein (ACRBP) zugeordnet werden, eine dem Ubiquitin konjugierenden Enzym UBE2I, eine Keratin 6 (K6irs2), drei dem Zytokin Rezeptor ähnlichen Molekül 9 (CREME9) und zwei konnten keinem bekannten Protein zugeordnet werden. CREME9 wurde aussichtsreichster Kandidat für die weitere Charakterisierung identifiziert und die physikalische Interaktion von CREME9 mit L1-EN durch eine GST-Fällung nachgewiesen.
Aus Hodengewebe wurde die vollständige cDNA von CREME9 isoliert und in ein stufenlos regulierbares Expressionssystem (ARIAD Pharmaceutical, USA) kloniert. Im langjährig etablierten Retrotranspositionstest (RTP-Test) konnte in HeLa-Zellen gezeigt werden, dass in Abhängigkeit der CREME9-Expression die L1-Retrotranspositionrate um bis zu 80% reduziert ist. Somit ist CREME9 möglicherweise ein negativer Regulator der L1-Retrotransposition.

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