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Dissertation zugänglich unter
URN: urn:nbn:de:gbv:18-61397
URL: http://ediss.sub.uni-hamburg.de/volltexte/2013/6139/


Caenorhabditis elegans model of tauopathy

Herstellung eines Caenorhabditis elegans-Tiermodells der Alzheimerkrankheit

Ghulam Jeelani, Pir

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SWD-Schlagwörter: Alzheimer-Krankheit
Freie Schlagwörter (Deutsch): Tauopathy
Freie Schlagwörter (Englisch): C.elegans
Basisklassifikation: 42.71
Institut: Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Hauptberichter: Mandelkow, Eckhard (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 14.12.2012
Erstellungsjahr: 2013
Publikationsdatum: 11.04.2013
Kurzfassung auf Englisch: Proteins under certain conditions polymerize to form soluble oligomers, which eventually lead to insoluble fibrillar or amorphous aggregates. This may lead to an obstruction of the cell and a reduced availability of the protein for normal functions. Tau is one example; under normal conditions, Tau is a highly soluble protein that binds and stabilizes axonal microtubules (Binder et al., 1985). However, Tau gets modified posttranslationally and forms highly ordered fibrillar aggregates which accumulate as neurofibrillary tangles in AD and other neurodegenerative tauopathies (Mandelkow and Mandelkow, 2012). In this study we have generated transgenic C. elegans lines in which full-length V337M Tau is co-expressed with different fragments of the Tau repeat domain in the nervous system. The repeat fragments differ by two point mutations in the hexapeptide motifs, which determine whether they can adopt a beta structure conformation and hence aggregate or not. The “pro-aggregant” C. elegans line co-expresses full-length V337M Tau along with the aggregation prone repeat fragment F3ΔK280. By contrast, the anti-aggregant line co-expresses full-length V337M Tau along with the repeat fragment F3ΔK280PP, which cannot aggregate due to the presence of two beta-sheet breaking prolines. The project was aimed at a better understanding of the role of Tau aggregation on cell toxicity and dysfunction in the context of a whole organism. An additional aim was to explore the potential for drug screening against Tau aggregation in a cost effective manner. The results are summarized as follows:
(i) The pro-aggregant animals show a severe uncoordinated phenotype (paralysis) starting at the first day of adulthood which is due to a defective pre-synaptic transmission. The nervous system of the pro-aggregant animals shows abnormalities in the form of neuronal gaps and defective axonal mitochondrial transport. By contrast, the control anti-aggregant animals show a rather mild phenotype.
(ii) The pro-aggregant animals accumulate detergent soluble and detergent
insoluble Tau aggregates starting at the first day of adulthood (roughly 60 hrs. after hatching) while anti-aggregant animals do not. The presence of Tau aggregates in pro-aggregant animals at such an early age allows one to attribute this phenotype to the presence of Tau protein and to distinguish it from age-related breakdown of proteostasis. Besides this, soluble and insoluble oligomeric Tau species of roughly 220 kDa appear in the pro-aggregant animals as shown by biochemical analysis. As a result, the pro-aggregant animals suffer from stress due to misfolded protein accumulation. This is the likely cause for decreased microtubule stabilization, defective axonal transport, and ultimately neuronal dysfunction.
(iii) Tau is extensively phosphorylated in the pro-aggregant animals at most of the sites found in the AD brain. Higher order soluble oligomeric Tau species (high salt soluble RAB fraction) of roughly 220 kDa were detected by AT8 antibody (pSer202 and pThr205 epitope) only in the pro-aggregant animals. These intermediate oligomers are thought to be the most toxic species. The pro-aggregant animals also developed detergent insoluble Tau oligomeric species of roughly 100 kDa detected by PHF-1 antibody (pSer396 and pSer404 epitope). The results show that human Tau can undergo post-translational modification in C. elegans to a disease state.
(iv) The severe uncoordinated phenotype in this animal model allowed us to test compounds against Tau aggregation. Several compounds can ameliorate the phenotype by reducing the Tau aggregates. This illustrates the usefulness of the C. elegans model as a fast and cost-effective tool for assessing potential drugs for Tau pathology.
Kurzfassung auf Deutsch: Während der Aggregation von Proteinen können unter bestimmten Bedingungen lösliche Oligomere enstehen, welche sich im Lauf der Polymerisation zu unlöslichen Fibrillen und amorphen Aggregaten zusammenlagern. Dies kann zur Behinderung zellulärer Abläufe führen und die Verfügbarkeit der Proteine für deren physiologische Funktionen reduzieren. Ein Beispiel für ein solches Protein ist das nativ gut lösliche Tau-Protein, welches an Mikrotubuli bindet und diese stabilisiert (Binder et al., 1985). Sobald Tau posttranslational modifiziert wird, bilden sich hoch geordnete fibrilläre Aggregate, welche akkumulieren und als sich als neurofibrilläre Bündel (NFT) ablagern, wie z.B. im Fall der Alzheimer-Krankheit oder anderen neurodegenerativen Tauopathien (Mandelkow and Mandelkow, 2012). In dieser Arbeit haben wir transgene Linien des Nematoden Caenorhabditis elegans entwickelt, welche die Mutante V337M der längsten humanen Tau-Isoform zusammen mit zwei verschiedenen Fragmenten der Tau-Repeat-Domäne im Nervensystem koexpremieren. Die Fragmente unterscheiden sich in Punktmutationen innerhalb der Hexapeptid-Motive, welche es entweder ermöglichen, dass das Fragement eine β-Faltblatt-Konformation ausbildet und aggregieren kann, oder dies verhindert. Die „Pro-Aggregations-Linie“ in C. elegans koexpremiert die TauV337M Mutante zusammen mit dem zur Aggregation neigenden Repeat-Fragment F3ΔK280. Im Gegensatz dazu koexpremiert die „Anti-Aggregations-Linie“ das TauV337M mit dem F3ΔK280PP Fragment, bei dem zwei Proline die Ausbildung einer β-Faltblatt-Struktur verhindern und daher eine Aggregation unterbinden. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Tau-Aggregation für die Zelltoxizität und Dysfunktionen innerhalb eines Organismus besser zu verstehen. Ein weiteres Ziel war es, dieses Modell für eine Suche nach Inhibitoren der Tau-Aggregation einzusetzen. Die Hauptergebnisse waren:
i) Die Pro-Aggregations-Tiere zeigen einen schweren unkoordinierten Bewegungs-Phänotyp (Paralyse), welcher am ersten Tag des adulten Entwicklungsstadiums auftritt und durch eine defekte prä-synaptische Übertragung hervorgerufen wird. Das Nervensystem der Pro-Aggregations-Tiere zeigt Abnormitäten in Form neuronaler Brüche und defektem axonalen Mitrochondrien-Transport. Im Gegensatz dazu zeigt die Kontroll-Linie der Anti-Aggregations-Tiere einen eher milden Phänotyp.
ii) Die Pro-Aggregations-Tiere akkumulieren Detergenz-lösliche und unlösliche Tau-Aggregate, beginnend mit dem ersten Tag des Erwachsenenstadiums (etwa 60 Stunden nach dem Schlüpfen), die nicht in den Kontroll-Tieren der Anti-Aggregations-Linie vorkommen. Das frühe Auftreten der Tau-Aggregate in den Pro-Aggregations-Tieren ermöglicht es, diesen Phänotyp auf die Anwesenheit des Tau-Proteins zurückzuführen und damit von dem altersbedingten Zusammenbruch der Proteostase zu unterscheiden. Biochemische Untersuchungen belegen außerdem das Vorkommen von Tau-Aggregaten mit einer Masse von etwa 220 kDa in den Pro-Aggregations-Tieren. Als Konsequenz zeigen diese Tiere eine Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen, die Ursache für eine verminderte Stabilität der Mikrotubuli, einem defekten axonalem Transport und schließlich der neuronalen Dysfunktion ist.
iii) Extrahiertes Tau-Protein aus den Pro-Aggregations-Tieren ist an bestimmten Aminosäuren stark phosphoryliert, wie es auch in Gehirnen von Alzheimer Patienten auftritt. Höher molekulare lösliche Tau-Oligomere mit einer Masse von etwa 220 kDa konnten mit dem Anitkörper AT8 (Epitop: pSer202 und pThr205) nur in Pro-Aggregations-Tieren nachgewiesen werden. Diese intermediären Tau-Oligomere werden als toxische Spezies diskutiert. Die Pro-Aggregations-Tiere entwickeln zudem eine Detergenz-unlösliche Tau-Oligomer-Spezies mit einer Masse von etwa 100 kDa, welche sich durch den PHF-1-Antikörper (Epitop: pSer396 und pSer404) detektieren läßt. Diese Ergebnisse belegen, dass humanes Tau in C. elegans bis zu einem pathologischem Status posttranslational modifiziert werden kann.
iv) Mit Hilfe des Phänotypes in diesem Tiermodel lassen sich Tau-Aggregations-Inhibitoren gegen die Aggregation von Tau testen. Einige der getesteten Substanzen können den physiologischen Phänotyp teilweise wieder herstellen, indem die Menge an Tau-Aggregaten reduziert werden. Das illustriert den Nutzen des C. elegans Models als schnelle und kosteneffektive Methode, um potentielle Medikamente gegen Tau-Pathologien zu identifizieren und zu bewerten.

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